三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯用系統的研制

　　摘要搭建了一種聯用超分辨熒光和三維形貌顯微成像系統(Correlativesuper鄄resolutionfluorescenceandthree鄄dimensionaltopographyimagingmicroscopy)，以聚合纖維狀肌動蛋白(F鄄actin)為例，評價了此聯用系統的性能。實驗結果表明，此聯用儀器具有納米級分辨率的三維形貌及具體成分的定位分布成像功能，可實現在形貌圖中定位具體成分的功能，表明此聯用儀器可應用于研究分析細胞骨架及細胞亞結構(如細胞膜蛋白質聚集體的組成和分布特性等)方面，此聯用系統在生命科學和材料科學等領域具有廣泛的應用前景。

　　關鍵詞超分辨熒光顯微鏡;原子力顯微鏡;聯用

　　1引言

　　原子力顯微鏡(Atomicforcemicroscopy，AFM)通過檢測針尖和樣品間微弱的相互作用力獲取樣品表面的各類信息[1]，是研究生物樣品的有力工具，具有獨特的優勢，如高分辨率(X、Y軸側向分辨率為納米級，Z軸垂直分辨率高達0.1nm)，無需對樣品進行固定染色處理，可以在溶液或近似生理環境中對生物樣品成像。

　　然而，AFM因缺乏特異性標記，難以提供分子種類的信息。超分辨熒光顯微鏡(Super鄄resolutionfluorescencemicroscopy，SRM)[2，3]是一類光學成像技術的總稱，根據成像原理可分為兩類:一類是基于特殊強度分布照明光場的超分辨顯微成像，如受激發射損耗顯微鏡(Stimulated鄄emissiondepletion，STED)[4]和結構光照明顯微鏡(Structureilluminationmicroscopy，SIM)[5];另一類是基于單分子定位技術成像的超分辨率熒光顯微成像，如光激活定位顯微鏡(Photoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM)[6]和直接隨機光學重構顯微鏡(Stochasticopticalreconstructionmicroscopy，dSTORM)[7]。SRM突破了傳統光學顯微鏡的光學衍射極限，其成像分辨率低至10nm，為生物樣品的研究提供了有利力的分析手段。

　　此外，超分辨成像技術可通過結合多色標記方法實現對多種成分的同時定位，可用于研究分析不同成分間的相互作用[8]。然而，SRM在三維形貌成像和Z軸垂直分辨率方面仍有明顯不足。雖然AFM和SRM均是先進的單分子成像技術，為單分子水平研究提供了強有力的技術支撐，但這兩種成像技術均存在自身的局限性，無法用于更復雜的生物學體系，如直接觀察研究細胞膜上的蛋白聚集體的組成成分及這些成分間的相互作用關系等。

　　近年來，為了克服單個儀器的技術限制，獲取有關樣品的更綜合全面信息，研究者致力于兩種及兩種以上儀器間聯用系統的研發[9，10]。由于AFM和SRM成像技術均能夠在單分子水平及生理條件下實現對生物樣品的成像，而且SRM可彌補AFM缺乏特異性標記的固有缺點，聯用AFM鄄SRM的顯微鏡成為儀器研發的熱點領域。Diaspro研究組搭建了AFM鄄STED及AFM鄄STORM聯用顯微鏡，并對細胞上的微管進行了聯用成像[11，12];Fang研究組將AFM和STED聯用，實現了對細胞絲狀偽足同步采集AFM和STED圖像[13];Odermatt等搭建了AFM鄄PALM聯用系統并用于活細胞成像[14]。這些研究結果表明，AFM和SRM的聯用有助于獲取更綜合和互補的信息，從而能夠更加深入地獲取樣品信息。

　　近年來，本研究組分別利用AFM和dSTORM成像技術對細胞膜的組織結構進行了研究[15~18]，但由于AFM和SRM各自的局限性，一些復雜的細胞膜相關問題(如膜蛋白聚集體的組成成分及聚集體中成分間的相互作用關系等)無法通過單獨的AFM或SRM成像技術解決。為實現在細胞膜形貌圖中對多種蛋白分子的精確定位，進而實現對膜蛋白聚集體的具體組成成分和成分間相互作用關系的研究，選擇分辨率最高的超分辨熒光顯微鏡dSTORM和AFM搭建聯用顯微鏡。

　　本研究構建了三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯用系統，可以實現兩種成像技術對同一樣品的聯用成像，并優化了儀器結構，通過對體外聚合纖維狀肌動蛋白(F鄄actin)的聯用成像，考察了此聯用儀器的性能。本研究為后續利用AFM鄄dSTORM聯用顯微鏡在單分子水平及近似生理環境的條件下同時將多種蛋白分子的精確定位與整體的細胞膜形貌關聯，進而定量研究細胞膜上的蛋白聚集體提供了技術支撐。

　　2實驗部分

　　2.1儀器與試劑

　　自行搭建的三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯用系統;5500掃描探針顯微鏡(美國Agilent公司);Ti鄄E倒置光學顯微鏡(日本Nikon公司);DNP鄄S型AFM探針(美國Bruker公司);CFIApoTIRF100伊物鏡(日本Nikon公司);iXonUltra888型EMCCD相機(英國Andor公司);MDL鄄芋鄄405nm鄄100mW半導體激光器、MRL鄄FN鄄639nm鄄500mW固態激光器、MGL鄄FN鄄532nm鄄500mW固態激光器(長春新產業光電技術有限公司);AOTFnC鄄400.650聲光調諧濾波器(法國AAOptoElectronic公司);ZT405/488/532/640rpc鄄XT二向色鏡、ZET532/640m發射濾光片、ET700/75m帶通濾光片(美國Chroma公司);FF01鄄559/34帶通濾光片(美國Semrock公司)。HCl(36%~38%)、MgCl2(北京化工廠)。

　　3鄄氨基丙基三乙氧基硅烷(3鄄Aminopropyltriethoxysilane，APTES)、N，N鄄二異丙基乙胺(N，N鄄diisopropylethylamine)、戊二醛(25%)、NaBH4、EGTA、咪唑、葡萄糖、葡萄糖氧化酶(190units/mg)、過氧化氫酶(12000units/mg)、茁鄄巰基乙醇(美國SigmaAldrich公司);牛血清白蛋白(BSA)、Tris堿(美國Genview公司);Alexa647標記的鬼筆環肽(美國Invitrogen公司);肌動蛋白聚合試劑盒(BK003，美國Cytoskeleton公司);除特定標注的試劑外，其余試劑純度均大于98%。

　　2.2實驗方法

　　2.2.1肌動蛋白(Actin)的聚合

　　根據試劑盒中的說明書，將游離球狀肌動蛋白(G鄄actin)在體外聚合，形成纖維狀肌動蛋白(F鄄actin)。首先將1mgActin凍干粉溶解于100滋L無菌水中，并等分為20份，于-20益保存備用。取一支Actin等分試樣，加入45滋L常規肌動蛋白緩沖液稀釋至1mg/mL，最后加入5滋L10伊肌動蛋白聚合緩沖液，在室溫下反應2h，獲得F鄄actin儲備液。儲備液可在4益下穩定保存1個月。

　　2.2.2聚合纖維狀肌動蛋白(F鄄actin)的聯用成像

　　用緩沖液A(2mmol/LMgCl2，1mmol/LEGTA，20mmol/L咪唑鄄HCl，pH7.6)將F鄄actin稀釋至10滋g/mL。取200滋L稀釋液，在APTES修飾的蓋玻片上沉積5min，并用緩沖液A清洗;用2%(w/V)戊二醛固定15min;用新制備的0.1%(w/V)NaBH4處理樣品7min，減少由戊二醛固定產生的背景熒光。將蓋玻片安裝在聯用儀器的樣品池中，加入緩沖液A，進行AFM成像。

　　成像后，取下樣品池，先用4%(w/V)BSA封閉樣品15min，再用Alexa647標記的鬼筆環肽在室溫下避光特異性標記F鄄actin1h，接著用緩沖液A清洗，最后，在樣品池中加入dSTORM成像緩沖液(50mmol/LTris鄄HCl(pH7.5)、10mmol/LNaCl，10%(w/V)葡萄糖、0.5mg/mL葡萄糖氧化酶、40滋g/mL過氧化氫酶和1%(V/V)茁鄄巰基乙醇)，并對相同區域進行dSTORM成像。

　　2.2.3AFM和dSTORM圖像間的匹配

　　參考文獻[14]的方法，通過對dSTORM的原始坐標點進行仿射變換(平移、縮放、旋轉和剪切)，實現AFM和dSTORM圖像之間的配準，采用自行編輯的MATLAB程序優化仿射變換參數及圖像配準。

　　3結果與討論

　　3.1聯用儀器裝置

　　三維超分辨熒光和形貌顯微鏡是由一臺原子力顯微鏡AFM5500和一臺倒置光學顯微鏡Ti鄄E組合搭建而成。對于AFM成像模塊，利用Si3N4探針DNP鄄S中的D針(彈性常數為0.06N/m)在AAC(AcousticAC)模式下對生物樣品在溶液中成像，以實現在近似生理條件下對生物樣品的無損高分辨成像。

　　dSTORM成像模塊主要由1臺倒置光學顯微鏡Ti鄄E配有100倍TIRF物鏡(數值孔徑為1.49)、3臺激光器(639、532、405nm)、1個聲光調諧濾波器(用于調節激光的開關與強度)、1個EMCCD相機及相應的二向色鏡、濾光片、透鏡構成。為進行dSTORM成像，首先需更換相應濾光片:二向色鏡ZT405/488/532/640rpc鄄XT、發射濾光片ZET532/640m、帶通濾光片ET700/75m(針對639nm激發通道)和FF01鄄559/34(針對532nm激發通道)以及設置采集參數(曝光時間20ms，EM增益300，圖片采集幀數10000)，之后用639nm或532nm激光(~2kW/cm2)激發樣品，并同時用405nm激光(0~1W/cm2)激活熒光基團。

　　AFM成像時，用PicoView1.12軟件(美國Agilent公司)采集512伊512像素的原始數據，并用Gwyddion軟件[19]處理分析，以獲取矩陣數據。dSTORM成像時，用Micromanager軟件采集原始圖片序列，并對其用ThunderSTORM軟件[20]處理，以獲取所有合格定位點的信息(如坐標、不確定度)。將原始AFM矩陣數據和dSTORM定位點數據導入MATLAB配準程序中，實現AFM和dSTORM圖像間的精細匹配。

　　3.2聚合纖維狀肌動蛋白的聯用成像

　　為了考察三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯用儀器的性能，采用G鄄actin在體外聚合形成的F鄄actin為測試樣品，進行聯用成像。顯示了一些纖維狀凸起物及一些球形顆粒。根據文獻[21]中報道的肌動蛋白結構，推測這些纖維狀凸起物和球形顆粒分別為聚合F鄄actin和游離G鄄actin。

　　此外，從AFM圖像中觀察到具有不同高度及寬度的纖維狀凸起物，推測這是由于F鄄actin的聚合程度不同引起的。為測定AFM鄄dSTORM聯用系統中的AFM成像模式能否提供高分辨圖像，本研究選擇寬度細小的低聚F鄄actin及粒徑小的游離G鄄actin進行高度及半峰全寬的測定，并與文獻[21]中報道的肌動蛋白尺寸進行比較，以確定AFM成像的分辨率。

　　通過對箭頭處低聚F鄄actin和游離G鄄actin進行高度分布分析及高斯分布擬合，獲得的低聚F鄄actin的高度及半峰全寬為10和30nm，游離G鄄actin的高度及半峰全寬為7和16nm。對比文獻[21]中報道的單個G鄄actin直徑(5.5nm)及單聚F鄄actin直徑(8nm)，發現箭頭處的G鄄actin和F鄄actin的半峰全寬雖然由于AFM探針針尖的加寬效應而大于文獻中報道的肌動蛋白尺寸，但測定的高度與文獻[12]中肌動蛋白尺寸相符，因此，本聯用系統中的AFM成像可實現對肌動蛋白的高分辨成像。

　　為測定聯用系統中的dSTORM成像分辨率，選擇寬度細小的低聚F鄄actin區域，并對其熒光強度分布進行高斯擬合，以測定F鄄actin的半峰全寬。dSTORM圖中所測得的低聚F鄄actin的半峰全寬為20~30nm，比單聚F鄄actin的直徑(8nm)大，表明聯用系統中的dSTORM成像可達到約20nm的分辨率，與文獻[14，22]中報道的dSTORM分辨率(20nm)相當。上述結果表明，搭建的聯用儀器可實現dSTORM的超分辨熒光成像。

　　為了將具體蛋白F鄄actin的分布精確定位到對應的三維形貌圖中，需將形貌圖中肌動蛋白的結構與基底區分。通過設置閾值(基底的高度)，可區分基底和肌動蛋白結構。為方便后續圖像匹配優化，將小于等于閾值的高度值定義為0，即h=0代表基底;將大于閾值的高度值減去閾值，即h值代表肌動蛋白的高度，且h>0代表肌動蛋白的結構。

　　將提取的肌動蛋白三維結構與具體蛋白F鄄actin的分布導入MATLAB配準程序中，并根據AFM和dSTORM圖中F鄄actin的結構，優化仿射變換參數以實現精確定位。為進一步定量分析AFM和dSTORM圖間的匹配效果，通過比較dSTORM定位點出現在基底處(h=0)以及F鄄actin處(h>0)的幾率來確定以及優化這兩種圖像間的重疊程度，即比較h=0及h>0處的dSTORM定位點密度。h>0處的dSTORM定位點密度為2353滋m-2，而h=0處的dSTORM定位點密度只有318滋m-2，表明dSTORM定位點出現在F鄄actin處的幾率大于出現在基底處，即證明AFM和dSTORM圖像間的重疊程度很好。綜上，此聯用儀器可實現在單分子水平上對具體成分的空間分布和整體形貌間的關聯分析。

　　4結論

　　搭建了三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯用系統，用聚合纖維狀肌動蛋白(F鄄actin)作為典型的樣品，證明此聯用系統可以提供高分辨率的AFM形貌圖和dSTORM重構圖(水平分辨率約20nm米，形貌圖的垂直分辨率高達0.1nm)，也證實此聯用系統能夠在整體形貌圖中精確定位具體蛋白的分布。此AFM鄄dSTORM聯用系統為單分子水平研究解析細胞膜蛋白聚集體組分及其形成機理提供了新的分析手段。此外，此AFM鄄dSTORM聯用系統也可應用于其它領域的研究，如材料精細結構和缺陷的分析以及生物活性分子與細胞的相互作用等。

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　　熒光探針常用于熒光免疫法中標記抗原和抗體，在微環境，微生物領域有廣泛的應用。這類從業人員在晉升職稱時也是要發表相關的論文。熒光探針論文發表和其他行業論文發表方法是一樣的，可以是作者自己聯系雜志社投稿，也可以是通過專業的論文發表機構安排投稿，成功率會高很多。

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