本文摘要：摘 要：本研究利用SCoT12引物對8個不同花生品種擴增產物中的一個長度多態性片段SCoT12-800進行克隆和測序分析，該序列登錄號為KM200036。結果表明，該片段多態性是由于其含有一段TC簡單重復序列(Simple Sequence Repeat， SSR)，根據該片段序列，利用Primer
摘 要：本研究利用SCoT12引物對8個不同花生品種擴增產物中的一個長度多態性片段SCoT12-800進行克隆和測序分析，該序列登錄號為KM200036。結果表明，該片段多態性是由于其含有一段TC簡單重復序列(Simple Sequence Repeat， SSR)，根據該片段序列，利用Primer 5.0軟件設計出一對適合SSR分子標記檢測的引物，命名為SCoT12-SSR，該引物的擴增產物大小為164～178 bp，在花生栽培種中可檢測到5個等位變異，可用于花生的遺傳多樣性、品種鑒定、基因定位和遺傳圖譜的構建等研究。
關鍵詞：花生;分子標記;SCoT;SSR
花生(Arachis hypogaea L.)又名落花生，是我國重要的經濟作物和油料作物之一。栽培花生是包含來自于不同野生品種A和B兩個基因組的異源四倍體作物[1]。研究表明，單一雜交多倍化以及在育種過程中高頻使用少數骨干親本，使得品種間的遺傳基礎趨于狹窄，基因組高度保守，遺傳多樣性降低[2]。因此，了解栽培花生品種間的遺傳多樣性，開發有效的遺傳多樣性標記對于花生育種以及種質鑒定都具有重大意義。
SSR(Simple Sequence Repeat)又稱為微衛星DNA，是指由2～6個核苷酸為基本單位多次串聯重復所構成的一段DNA序列。SSR標記技術與目前常用的如RFLP、RAPD、STS、SCAR、SPAR、AFLP等標記技術相比， 具有分布均勻、簡單快速、穩定性高、重復性好以及多態性豐富等優點，因此在水稻[3]、玉米[4]、小麥[5]等作物研究中得到了廣泛應用。花生SSR分子標記的開發相對緩慢，雖然目前已經公布的花生SSR分子標記數達到了15 518，但只有13.5%～14.5%的分子標記在花生栽培種中具有多態性[6，7]，很難滿足現今的科研需求。
1.2.2 PCR產物電泳檢測 SCoT-PCR與SSR-PCR產物分別使用濃度為3.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠和6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(電泳緩沖液0.5×TBE，電壓150 V，時間2 h)，0.1% AgNO3染色，對電泳結果進行拍照。測序片段檢測及回收使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用GelRed(Biotium，USA)染色，在紫外凝膠成像系統上觀察并切下目標條帶所在膠塊放入2 mL EP管中備用。
1.2.3 PCR產物目的片段回收、連接載體及測序 目的片段的回收、純化使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。將回收的目的片段與pMD19-T Vector(Simple)(TaKaRa，大連)連接后，使用熱激法轉化Top10感受態細胞[天根生化科技(北京)有限公司]，并進行藍白斑篩選，挑選白色菌斑進行PCR檢測，方法參考產品說明書。將檢測后陽性克隆菌落接入5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中37℃振蕩培養過夜。將過夜培養菌液送金斯瑞生物科技有限公司進行測序。測序及菌落PCR檢測均使用M13引物(引物序列見表1)。
1.2.4 測序結果分析 測序結果經DNASTAR軟件中SeqMan拼接完整，利用MegAlign比較不同供試材料間該位點的多態性，并通過NCBI BLAST進行相似性檢測以及閱讀框分析。
2 結果與分析
2.1 SCoT12擴增產物多態性分析
在8個供試品種中，SCoT12引物可擴增出11條清晰、穩定條帶(圖1)，片段大小在300～2 000 bp之間。其中，不同品種在800 bp處均可檢測到一條大小有微小差異的片段，將該片段命名為SCoT12-800。
2.2 SCoT12-800陽性克隆檢測
使用M13引物對重組載體pMD19-T+SCoT12-800的轉化菌株的不同單克隆進行PCR檢測(圖2)，其中有SCoT12-800片段插入的克隆PCR擴增片段長度應為930 bp左右，而有些克隆的擴增片段長度不在上述范圍，可能是pMD19-T載體在連接過程中插入了其他片段或是載體發生自連而產生了假陽性。
目標起始密碼子多態性(Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT)分子標記是由Collard和Mackill[8]開發的一種目標分子標記新技術，該標記依據植物基因中ATG翻譯起始位點側翼序列的保守性，設計單引物對基因組進行擴增，并對擴增產物進行電泳檢測。SCoT分子標記技術產生的標記大部分是顯性標記(引物結合位點的點突變)，但也會產生像RAPD標記技術一樣的由于插入-缺失突變引起的長度多態性共顯性標記，其產物片段大小在200～2 000 bp之間。SCoT分子標記作為一種新型的分子標記具有操作簡便、可在各物種間通用、能有效產生與性狀連鎖的標記等特點。目前，該標記技術已在水稻、馬鈴薯[9]等作物中成功應用，在花生中也有報道[10，11]。但由于該技術采用單引物擴增，使其存在擴增條帶過多，特別是一些共顯性插入-缺失片段由于差異不明顯而造成結果不易分析等缺點。
本研究利用已公布的SCoT分子標記對8個不同的花生品種進行多態性分析，發現其中一個引物SCoT12擴增產物中的一個片段存在長度多態性差異。測序結果表明該片段包含一段TC重復，并利用該序列成功開發出了一個具有多態性的SSR分子標記。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
8個供試品種，分別為950527、花育22號、DF12、開農176、開17-15、York-1、Q13-2-1、Q13-21-1。所用供試材料均種植于山東省花生研究所試驗基地，并在苗期取健康植株上的無病蟲害幼嫩葉片，液氮速凍后于-70℃保存。
1.2 試驗方法
1.2.1 DNA提取及PCR反應 基因組DNA提取采用小量CTAB法，并做了相應改良。SCoT-PCR反應體系及反應程序參照熊發前等[12]報道的方法進行優化。優化后的PCR體系總體積為10 μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技(北京)有限公司]3.75 μL、0.5 μmol/L引物、50 ng基因組DNA。PCR程序為94℃預變性5 min;94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環;72℃最后延伸5 min。SSR-PCR反應程序為94℃預變性5 min;94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環;72℃最后延伸5 min。SCoT-PCR使用SCoT12引物[11]，SSR-PCR使用根據測序結果開發的SCoT12-SSR引物(引物序列見表1)。
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