組織透明化技術的研究與應用

　　摘要背景：對生物體進行全身細胞分析是生物醫學領域的主要挑戰之一。組織透明技術結合光學成像和圖像處理技術，能夠將整個器官或全身快速透明并進行結構和細胞分析，為在生命科學中應用先進的光學技術提供了一個非常有前景的解決方案。目的：分析組織透明技術原理及過程，總結組織透明技術研究進展，介紹組織透明成像技術，討論組織透明技術在生物醫學研究領域中的應用。方法：第一作者以“tissueclearingtechnique，tissueopticalclearing，whole-bodyimaging，3Dimaging”為關鍵詞，檢索PubMed數據庫發表的相關文獻，初檢文獻168篇，系統整理、篩選后，對納入的72篇文獻進行分析、總結和討論。

　　結果與結論：目前組織透明技術主要分為兩類，有機溶劑透明技術和親水性試劑透明技術，組織透明步驟包括：①組織固定;②透化作用;③脫色作用;④折光率匹配。組織透明技術能夠使組織快速光學透明，顯著提高成像深度和圖像對比度，結合顯微成像技術如共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡和光片顯微鏡等，能夠在單細胞水平實現全身或全器官的高分辨率三維成像，加速了生物體全身細胞分析進程。未來，組織透明技術將會持續發展，并將推動新型透化試劑和透化專用顯微鏡的研發，從而加強從完整機體系統獲取結構和分子信息，有助于對完整生物系統的綜合理解。

　　關鍵詞：組織透明技術;三維成像;全身細胞分析;光散射;折射率匹配;顯微成像技術

　　0引言

　　Introduction從復雜的生物體中提取詳細的結構和分子信息，同時保留理解系統功能所需要的全局視角是疾病研究的關鍵，也是生物醫學研究領域的根本性挑戰。通過對完整生物機進行全面系統的分析，可以獲取諸多有價值的結構相關信息，對于腫瘤及神經系統等疾病的治療及發病機制的研究極為重要。計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層掃描(PET)和近紅外成像等先進成像技術的發展及應用，揭示了活體動物的解剖結構，但是由于缺乏高對比度的細胞標記工具，這些成像技術無法實現單細胞的特性分析。傳統組織學技術能對固定組織中的細胞進行空間表型分析，但需要進行組織連續切片和圖像重建，費時費力，并且在圖像重建過程中容易出現結構信息丟失[1-2]。

　　全自動切片技術的發展極大程度地節省了人力和時間，目前結合分子標記技術，已成功繪制出嚙齒類動物大腦結構圖[3]。但是這種精細的結構重建通常只適用于體積較小的組織。雙光子顯微鏡的發明打破了傳統顯微鏡成像深度為100μm的限制[4]，使組織成像深度增加至幾毫米[5]，但是生物組織的高度不透明性限制了這些技術的應用，隨著光向深層組織的傳播，成像分辨率和對比度也會隨之降低，因此仍然無法實現較大組織或器官的完整三維像。減少生物組織的光散射和光吸收是增強光學成像深度的有效解決方案[6]，White利用育種技術制作出一條透明的成年斑馬魚，該模型已經被用于實時研究癌癥的病理變化和發展[7]，但這種方法不適用于人類或其他動物的研究。

　　近年來組織透明技術的發展促進了生物體三維成像的進程，組織透明化技術是通過對樣本進行固定、透化、折光率匹配等處理，使組織變得光學透明，降低樣本的光散射和光吸收，從而增加成像深度及對比度[8]。在保持組織結構完整前提下，組織透明技術能實現細胞水平的三維成像，避免了空間結構信息的丟失，因此組織透明技術是打開光學顯微鏡潛能的關鍵技術，也是繪制全器官或全身細胞圖譜的最佳選擇方案之一。文章目的在于綜述近年來組織透明技術的研究進展，介紹組織透明技術與顯微成像技術的聯合應用，討論組織透明技術在生物醫學研究領域中的應用進展及研究意義。

　　1資料和方法Dataandmethods

　　1.1資料來源

　　第一作者利用PubMed數據庫，以“tissueclearingtechnique，tissueopticalclearing，whole-bodyimaging,3Dimaging”為關鍵詞，檢索1914年至2019年發表的相關文獻，初檢文獻168篇。

　　1.2納入標準納入與組織透明技術及應用相關的外文文獻，包括研究原著、綜述、論著等。

　　1.3排除標準重復性研究。

　　1.4數據提取PubMed數據庫初檢文獻116篇，閱讀題目、摘要進行初篩，閱讀全文進行二次篩選，最終保留文獻72篇。

　　1.5質量評估

　　最終保留的72篇文獻，符合納入標準，適合用于后續分析、總結。

　　2結果Results

　　2.1組織透明技術原理及過程

　　生物組織的不透明性是由不同光學特性的非均質成分造成的，如折射率(RI)和光吸收率，大多數生物組織由高折射率的散射粒子，如脂質、蛋白、髓鞘，彈性纖維，以及低折射率的周圍介質，如細胞間質液和細胞質共同組成的。由于每種成分具有不同的折射率，這種非均質物質結構會使入射光發生散射，限制了光學成像深度[9]。此外，內源性色素如血紅素、核黃素、黑色素和脂褐素的光吸收也會使光傳播衰減[10]。因此改變組織非均質成分的光學特性，降低光散射和光吸收是增加組織成像深度的關鍵。

　　1個世紀前，SPALTEHOLZ[11]首次引入3D組織標本的透明原理，在此研究基礎上，GENINA等[12]將組織浸入光學透明劑中平衡折射率，使組織變得更加透明，進一步增加了成像深度。隨著光學顯微鏡的發展和普及，以及數據采集和存儲技術的進步，組織透明技術使全器官甚至全身成像成為可能，近年來研究人員開發出一系列組織透明技術，所有透明技術都致力于平衡組織折射率，以減少光散射的不均一性。

　　組織透明技術過程：盡管目前存在大量的組織透明技術，但它們主要包括以下2-4個步驟[13]：①組織固定;②透化處理;③脫色;④折光率匹配。組織固定是組織透明過程中保存目的蛋白和分子的關鍵步驟，常用的固定方案包括多聚甲醛PFA固定，水凝膠包埋，戊二醛固定等。透化作用是促進高折射率介質向深層組織滲透的重要環節，目前常用透化試劑包括三類：①水溶性有機溶劑;②高水化試劑;③脫脂試劑。脫色是實現全器官透明的必要步驟，因為內源性色素會衰減光的傳播，干擾觀察。折射率匹配是利用高折射率介質平衡透化組織的折射率，使整個組織折射率均勻化。

　　2.2組織透明技術分類

　　目前組織透明技術主要分為兩類：有機溶劑透明技術和親水性試劑透明技術。

　　2.2.1有機溶劑透明

　　有機溶劑透明技術主要是應用含有高折射率介質的光學透明劑取代組織中水分和脂質來平衡組織折射率，使組織達到光學透明。透明方案包括2個步驟：①脫水/脫脂;②光學透明劑浸透。高折射率介質與水不混溶，因此需要應用有機溶劑進行組織脫水，脂質是光散射的主要來源，脂質雙分子層決定細胞膜的通透性，因此，組織脫水后必須進行脫脂處理，以促進光學透明劑向深層組織滲透。SPALTEHOLTZ[11]首次應用有機溶劑透明組織樣本，制作出光學透明器官，推動了解剖學的發展進程。DODT小組[14]在此基礎上進行改良，采用乙醇脫水，BABB脫脂，透明完整小鼠胚胎和新生小鼠大腦，結合光片顯微成像技術，對完整海馬進行三維圖像，獲得了CA1神經元樹突樹和樹突棘在細胞分辨率水平的三維圖像。

　　但是，苯甲醇-苯甲酸芐酯(BABB)透明最大的缺陷是乙醇脫水會導致內源性熒光蛋白淬滅，為了解決這一問題，ERTÜRK小組[15]應用四氫呋喃孵育代替乙醇脫水，保護綠色熒光蛋白(GFP)信號，同時應用二芐醚(DBE)替代BABB以提高透明效率，開發出基于四氫呋喃和DBE的新型透明方案3DISCO。3DISCO能夠快速透明多種器官組織，包括小鼠大腦，肺臟，腫瘤及人類胚胎等[16-18]，并有效延長了綠色熒光蛋白的表達時間。為了充分保存內源性熒光蛋白，RENIER團隊[19]結合3DISCO透明，建立了一種全組織包埋免疫標記的三維成像技術iDISCO，應用免疫標記實現目的蛋白的可視化。

　　iDISCO通過組織脫水脫脂，增加抗體滲透性，能夠對小鼠胚胎及成年小鼠組織(如腎臟，大腦)進行可視化三維免疫標記，結合AAV2病毒示蹤，iDISCO展示了視神經損傷后神經退變及再生的三維成像。雖然3DISCO能夠保護內源性熒光蛋白，但是DBE的降解產物如過氧化物或醛類物質，會對熒光蛋白產生有害干擾，熒光蛋白信號僅能維持幾天，為了克服這一缺陷，Dodt引入抗氧化劑沒食子酸丙酯抑制DBE降解產物的積累，設計出sDISCO透明方案，高效透明組織樣本的同時，有效保存透明樣品的熒光信號和組織結構，結合STED，樹突棘結構清晰可見[20]。

　　為了更有效地保存內源性熒光蛋白，ERTÜRK小組開發出一種基于DPE的透明技術uDISCO，可以高效透明嚙齒類動物及臨床人類標本[21]，有效保存熒光蛋白信號長達數月，結合顯微成像技術，uDISCO能夠完成小鼠全身血管生成的三維成像，此外，uDISCO可以與多種標記技術兼容，如病毒示蹤和免疫染色[21]。但是對于綠色熒光蛋白表達水平較低的樣品，uDISCO保存熒光蛋白信號的能力并不理想。朱丹課題組在uDISCO基礎上，調整試劑pH值，推出改良透明方案a-uDISCO[22]，能夠更好地保留綠色熒光蛋白熒光，并且以高質量成像展示了整個小鼠大腦神經元網絡，a-uDISCO是綠色熒光蛋白低表達樣品成像的優先選擇。為了增強熒光蛋白信號強度，CAI等[23]隨即開發出一種基于納米體的全身免疫標記技術vDISCO，納米體標記顯著提高了熒光染料對大型組織的標記效率，使熒光信號強度增強100倍，因此能夠對透明小鼠進行從頭到腳的光學成像和亞細胞水平的量化分析。

　　結合光片顯微，ERTÜRK團隊首次構建出成年小鼠神經元全身投射圖，并揭示了急性中樞神經系統損傷后遠端神經末梢的投射變化和炎癥過程。雖然uDISCO能夠透明大部分小鼠器官，但是對肝臟、脾臟等器官以及硬組織的透明效果欠佳，為了提高全身透明效率，趙瑚團隊開發出一種基于聚乙二醇(PEG)的新型全組織透明技術PEGASOS[24]，通過脫鈣，脫色，脫水，脫脂等優化處理，該透明技術首次實現了對動物軟、硬組織的同時透明化，包括骨骼、牙齒、大腦、肌肉等，結合Thy1-EGFP轉基因小鼠，趙瑚團隊對完整脊柱進行三維成像，展示了脊髓神經纖維走行以及DRG與脊髓的連接關系。基于有機溶劑的透明技術在透明動力學上具有一定的優勢，能快速高效透明多種類型組織樣本。但是有機溶劑透明會導致樣本大幅度皺縮，對組織結構和蛋白具有潛在的破壞性;此外有機溶劑具有一定的毒性和腐蝕性，需要特殊防護，并且需要特殊物鏡進行成像，限制了其廣泛應用。

　　2.2.2親水性試劑透明

　　由于有機溶劑透明存在一定的局限性，許多研究人員開始尋求基于親水性試劑的透明方案。目前，親水性試劑透明主要包括2種：單純浸泡透明和高水化脫脂透明。

　　2.3組織透明成像技術

　　目前顯微成像技術正在以驚人的速度發展，這些顯微成像技術包括共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡，光片顯微鏡和光學相干斷層掃描等[47-48]。其中雙光子顯微鏡最適合用于非透明組織的深部成像。然而組織透明技術去除了光散射造成的穿透限制，這將意味著成像深度不再受樣本的限制，而是受物鏡的限制，目前應用于透明組織光學成像技術主要包括以下幾種：

　　2.3.1共聚焦和雙光子顯微鏡成像

　　組織透明成像的主要限制因素是物鏡工作距離，而不是光的穿透，因此大軸向行程的立式顯微鏡對于適應較長工作距離的物鏡和較厚樣品是必不可少的。目前大多數顯微鏡制造商都推出了超長工作距離(>5mm)和高NA(>0.9)的物鏡，所以共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡都可以用于透明樣品成像。對于多種染料標記的樣品，共聚焦成像會產生更好的信噪比，因為單光子激發效率較高，交叉激發可能性低，此外，由于激光之間的快速切換(無需調諧)，可以更快地獲得多色共聚焦圖像。

　　雙光子顯微鏡在進行較厚組織Z軸掃描時，能夠防止焦平面以外的區域發生光漂白作用，此外應用近紅外光作為激發光源，具有更強的組織穿透能力，因為即使透明樣本也會存在一定程度的短波散射[49]。然而，雙光子和共聚焦成像技術最主要的局限在于成像速度，激光掃描是一個耗時緩慢的過程。使用20X/1.0NA物鏡掃描整個體積為1000mm3的小鼠大腦，即便以相對較快的掃描頻率1hz進行掃描，也需要將近50d[50]。因此，對于透明組織，雙光子和共聚焦成像只適用于較小區域的高分辨率成像。

　　2.3.2光學投影斷層成像

　　光學投影斷層成像通過收集樣品不同角度的透射投影圖像，重建樣本三維信息，能夠對厘米尺度的樣本進行快速明場和熒光的三維成像，是大體積生物標本成像的理想選擇之一[51]。目前光學投影斷層成像已廣泛應用于神經科學領域，研究胚胎發育及全腦神經網絡連接等。結合組織透明技術，光學投影斷層成像成功檢測了多種組織類型樣本，包括發育中的小鼠胚胎、異種移植瘤組織、小鼠整個心臟、腎臟、大腦半球以及白色脂肪組織[52-53]。最近，BAN等[54]開發出無需組織標記的光學投影斷層成像(LF-OPT)，LF-OPT采用衰減對比度進行成像，因此無需任何熒光或染料標記即可實現對普通胚胎的三維成像，擴大了光學投影斷層成像的應用范圍。

　　2.3.3光片顯微鏡成像

　　組織透明成像技術推動了光片顯微鏡的再發展[9]，光片顯微鏡應用激光光束從側面激發熒光樣品，并通過垂直CCD來獲取檢測成像，由于激發與檢測路徑是分離的，且單個x-y平面圖像在一次掃描中獲得(無需線掃描)，所以可以將光漂白和光學損傷降低到最低。相機讀取速度以及焦平面移動速度是采樣時間的主要限制因素，LSFM結合sCMOS相機，拍攝速度高達100幀，因此LSFM能夠實現大體積樣本的高速、高信噪比成像[32，55]。這些優點滿足了系統生物學的研究要求，諸多實驗將光片顯微鏡用于全器官成像，包括對動物胚胎發育的時空監測[56]，魚和蒼蠅全腦神經活動的功能成像[57]，或者小鼠全腦成像[58]。綜上所述，LSFM是以高通量方式獲取透明組織3D成像的最佳途徑之一。

　　2.4組織透明技術在生物醫學研究領域的應用

　　組織透明化技術的發展使大型生物樣本變得透明，為生物組織結構的三維可視化打開了大門，并為進一步探索人類疾病的復雜性提供了嶄新的平臺，近年來組織透明技術在生物醫學研究領域得到了廣泛應用。

　　3討論Discussion

　　組織透明技術可以將完整組織或器官轉化為光學透明形式，結合顯微成像技術，極大推動了體積成像(全身或全器官成像)的進程，有助于加強對完整生物系統的綜合理解，為生物醫學研究領域提供了強有利的工具。近年來，組織透明技術發展迅速，多種新型透明技術不斷涌現，不同的透明技術具有特定的組織適用性，研究者應該根據實驗目的，選擇合適的透明方案。有機溶劑透明優勢在于透明質量和速度，因此更適合全身或者大器官透明，uDISCO和PEGASOS均可高效透明整個小鼠身體[21，24]，并且能夠保存內源性熒光蛋白長達數月，因此是全身透明的首選方案;基于親水性試劑的CUBIC-2通過脫鈣、脫色等優化處理也可以有效透明小鼠全身[41]，基于水凝膠包埋的ACT-PRESTO雖然可以透明小鼠全身[70]，但透明效果欠佳，并且需要特殊設備，因此不適合用于全身透明。

　　親脂性染料如DiI是常用的神經示蹤劑，在神經環路研究中發揮重要作用，SeeDB，FRUIT，Scale等透明方法[25，27-28]，操作簡單，成本低廉，脂質成分保存完好，與親脂性染料有較好的兼容性，但是透明效率較低，只適合組織片或小樣本DiI染色的透明，相比而言，SWITCH和ScaleS具有較高的透明效率[26，37]，同時能夠保留親脂性染料，因此是大樣本透明的首選。

　　基于凝膠包埋的透明技術，如CLARITY，PACT-PARS，SWITCH，SHIELD[29，33，38，59]，通過共價交聯作用，能夠有效保護組織結構，生物分子以及RNA，因此可以進行RNA轉錄本分析以及應用透射電鏡進行超微結構分析，但是對硬組織的透明效果不理想，如骨骼、牙齒。綜上所述，沒有一種單獨的透明技術能夠滿足所有實驗需求，研究者需要根據組織樣本的類型、體積以及成像需求選擇最優的透明方案。雖然組織透明技術發展迅速，但是目前仍然面臨一些挑戰，阻礙了體積成像技術的大規模應用。首先是透明速度和質量，目前組織透明技術主要集中在嚙齒類動物，對于靈長類動物或人類標本的透明還局限在組織切塊水平，并且透明時間較漫長，目前還沒有實現完整狨猴大腦的透明，未來應該著重開發更加高效、無毒的透明試劑，以提高靈長類動物組織的透明質量和速度。

　　其次，抗體染色深度是組織透明技術的主要挑戰之一，由于抗體和熒光基團分子量較大，在組織中的滲透速度緩慢，因此需要較長的孵育時間，此外，抗體在深層組織的擴散和結合呈現非線性，導致組織染色不均勻。雖然AbScale，PACT-PARS，ACT-PRESTO，Ce3D等透明方法能夠顯著提高抗體滲透速率[26，44，70-71]，但染色深度也只局限在幾毫米，無法實現完整器官的三維免疫標記。使用單域抗體、核酸適配體或者納米體應該能提高組織滲透性和染色均勻性，vDISCO應用納米體代替傳統抗體，顯著提高了樣本標記效率，并實現了對Thy1-GFP小鼠完整神經投射的標記[23]。但是目前納米體種類較少，未來有待于開發更多類型的納米體，同時結合微波技術或電泳技術，增強對生物體的三維免疫標記。

　　此外，成像深度和分辨率也存在一定的限制，超長工作距離和高NA的物鏡是體積成像必不可少的，光片顯微鏡LSFM擁有工作距離>5mm，NA>0.9的物鏡，但物鏡放大倍數有限(1.26x-12.6x)[5]，極大限制了圖像分辨率，因此急需開發透化專用的超長工作距離高倍物鏡，加快實現亞細胞分辨率的體積成像。自適應光學可能會促進體積成像的進程，目前自適應光學已廣泛用于天文學中大氣光散射的糾正，這種技術通常是基于傳感器來檢測返回光波陣面的變形，并通過變形反射鏡或空間光調制器來糾正這些變形，目前正被應用于顯微鏡成像，以提高光在非透明樣品中的穿透深度[72]。

　　雖然自適應光學本身在較深組織內并不能產生清晰的圖像，但當與組織透明技術相結合時，成像深度和分辨率可能會大幅度增加。除了成像限制，后期大容量圖像數據集處理也存在一定的挑戰，需要使用具有大容量內存和專業軟件的專用工作站，同時，處理和分析超大數據集的新型開源解決方案有待于進一步開發，以便更好地理解這些成像方法所揭示的細胞之間的復雜關系。未來組織透明技術將會繼續發展，新型透明試劑、免疫標記、顯微鏡設計以及大型數據集分析等方面的技術進步將為生物醫學科學家繪制全身單細胞圖譜鋪平道路。

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