小菜蛾Toll6基因的克隆及功能分析

　　摘要：為探究Toll基因在小菜蛾先天免疫中的功能，對克隆鑒定的Toll基因序列進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR檢測Toll基因的時空表達模式及微生物侵染響應模式，體外驗證其在微生物結合、病原相關分子模式(athogenassociatedmolecularpattern，PAMP)結合、細菌凝集等方面的功能。結果表明：Toll基因全長2313bp，編碼770個氨基酸，預測Toll6蛋白具有富含亮氨酸重復序列的LRR胞外區、跨膜區和TIR胞內等典型Toll受體家族特征;Toll基因在不同發育階段及不同組織中均有表達，其中成蟲期表達量最高，齡幼蟲次之，在齡幼蟲中腸表達量最高;此外，蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾齡幼蟲6h后，Toll基因表達被顯著抑制，而黏質沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6侵染小菜蛾齡幼蟲12h時，Toll基因表達被顯著上調，18h后Toll基因表達被顯著抑制;蛋白體外功能驗證表明Toll蛋白不僅與細菌和真菌具有直接結合能力，還能與肽聚糖和脂多糖結合，但不具備細菌凝集功能。表明Toll蛋白可能作為模式識別受體直接識別并結合入侵病原微生物表面的PAMP，啟動小菜蛾對入侵病原微生物的先天免疫防御，且對不同微生物可能具有不同的響應機制。

　　關鍵詞：小菜蛾;Toll受體;先天免疫;模式識別受體;基因表達;病原菌侵染

　　免疫系統對昆蟲適應細菌、真菌、病毒以及真核寄生蟲等的復雜環境至關重要(Zhangetal，2019)，是昆蟲生存和繁衍的前提與保障。昆蟲不具備高等脊椎動物的獲得性免疫系統，先天免疫系統成為其抵御病原微生物感染的重要防御體系。Toll通路是與先天免疫有關的主要信號通路之一，其響應真菌和革蘭氏陽性菌的感染，在免疫防御中具有重要作用(Wangetal，2018)。

　　昆蟲Toll受體是Toll通路中的關鍵效應因子，能夠識別胞外特異性配體并引發胞內信號通路的級聯反應，在維持Toll信號通路的正常免疫應答及抵抗入侵病原微生物的過程中扮演著重要角色(廖文麗等，2017)。闡明Toll受體的功能是理解昆蟲Toll信號通路以及相關免疫防御機制的基礎。Toll受體最早在果蠅中發現，并被鑒定為一種跨膜受體，不僅參與機體發育，而且參與對真菌和革蘭氏陽性細菌的免疫應答(Nicolasetal，1996)。

　　人體內鑒定得到10個Toll樣受體(olllikereceptor，TLR)，其作為典型的模式識別受體(patternrecognitionreceptor，PRR)，與特定病原相關分子模式(athogenassociatedmolecularpattern，PAMP)直接結合進而誘導相應的免疫防御響應(Takeda&Akira，2005)。在甲殼類動物中，Toll受體發揮免疫功能的作用方式因物種不同而異，如日本囊對蝦MarsupenaeusjaponicasToll受體與哺乳動物相似，作為PRR激活Toll信號通路(Sunetal，2017);日本沼蝦MacrobrachiumnipponenseToll受體既可作為PRR識別外源入侵物，又可作為細胞因子受體與活化的內源性配體結合(Panetal，201)。

　　在昆蟲中，Toll受體不僅可以作為跨膜受體與活化的神經生長因子同源物Spätzle配體結合，激活胞內Toll信號通路，調控抗菌肽的表達(Nieetal，2018)，而且昆蟲Toll受體還能直接作為PRR與特定的PAMP結合，發揮免疫學功能(Nakamotoetal，2012;廖文麗等，2017)。

　　昆蟲由于其物種多樣性、生存環境的多態性，其免疫功能也會發生物種分化，具備種屬的特異性，因此從昆蟲Toll受體發揮免疫功能作用方式探究其誘導的免疫防御反應對于闡明昆蟲Toll受體功能及其介導的免疫防御機制具有重要意義。小菜蛾Plutellaxylostella是世界性害蟲之一，對十字花科蔬菜具有極強的破壞性，其抗藥性高，已對包括Bt在內的所有用于防治的殺蟲劑均產生了抗性(徐艷聆等，2006;Furlongetal.，2013)。生物農藥是未來農藥產業發展的趨勢，但小菜蛾的免疫防御反應能夠降低或者延緩微生物農藥的作用效率(彭露等，2015)。

　　因此，從小菜蛾抵御入侵病原微生物的免疫防御系統——Toll通路入手，探究Toll受體的免疫應答機制對于生物農藥的改良與新型生物農藥的開發具有重要意義。Xiaetal(2015)通過比較基因組學從小菜蛾基因組中鑒定到個Toll受體基因;Linetal(2018)研究表明小菜蛾Toll和Toll10基因參與細菌和真菌的免疫應答，但Toll基因在先天免疫系統中所扮演的角色及其是否與病原體直接結合未見報道。因此，本研究通過克隆表達小菜蛾Toll基因，研究其表達模式和免疫防御響應，并在體外驗證其在PAMP結合、微生物結合及細菌凝集等方面的功能，以期為后續深入探究Toll受體在小菜蛾先天免疫反應中的功能奠定基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　供試昆蟲和菌種：供試小菜蛾為以人工飼料飼養的小菜蛾Bt敏感品系SLss，由中國科學院動物研究所提供，于福建農林大學應用生態研究所人工氣候室內飼養，人工氣候室溫度(25±2)°C、相對濕度70%~80%、光照周期為16L：8D，幼蟲用人工飼料飼喂，成蟲用10%蜂蜜水飼喂。供試大腸桿菌Escherichiacoli菌株BL21、大腸桿菌感受態細胞DH5α、含pGTf2質粒的大腸桿菌感受態BL21(DE3)、畢赤酵母Pichiapastoris、蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010、金黃葡萄球菌Staphylococcusaureus、腸桿菌Enterobactersp.菌株EbPXG5和黏質沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6，均由福建農林大學應用生態研究所保存。

　　培養基：LB(LuriaBertani)液體培養基成分為5g酵母抽提物、10g蛋白胨、10g氯化鈉，去離子水定容至1L;LB固體培養基為LB液體培養基中添加瓊脂粉15g;酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD)成分為10g酵母抽提物、20g蛋白胨、20g葡萄糖，去離子水定容至1L。

　　試劑：Trizol，美國Invitrogen公司;膠回收試劑盒，瑞士Omega公司;PhantaMax高保真酶(P505)、2×PhantaMaxuffer等PCR試劑，南京諾唯贊生物科技股份有限公司;TOPOBlunt平末端克隆試劑盒、牛血清蛋白(bovineserumalbumin，BSA)、兔抗Histag多克隆抗體，上海翊圣生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、GoTaq®qPCRMasterMix、CXR參比染料等熒光定量試劑，美國Promega公司;FastKing一步法反轉錄試劑盒、質粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;pET28b質粒，重慶優寶生物技術股份有限公司;NotⅠ、T4DNALigase，日本TAKARA公司;NcoI，美國NEB公司;Western半干法轉膜液，上海碧云天生物技術有限公司;HRP羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司;4%多聚甲醛、TMB單組分顯色液、終止液、異硫氰酸熒光素酯FITC，北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。

　　儀器：GHP9080型隔水式恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司;JD801型凝膠成像儀，江蘇省捷達科技發展有限公司;DYY10C型電泳儀，北京六一儀器廠;5331型PCR儀、5810R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司;T6型紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司;SP8型激光共聚焦顯微鏡，徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司;Synergyh1型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司;NanoDrop2000型微量測定儀，賽默飛世爾科技公司;OLYMPUSIX71倒置相差熒光顯微鏡，奧林巴斯公司;96孔板，美國BioRad公司。

　　1.2方法

　　1.2.1小菜蛾Toll6基因的克隆

　　采用Trizol法提取5頭小菜蛾3齡幼蟲總RNA，采用微量測定儀檢測RNA濃度與質量，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。參照FastKing一步法反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以此為PCR擴增模板。根據小菜蛾基因組數據庫DMBDB(ftp://iae.fafu.edu.cn/pub)提供的小菜蛾Toll6基因序列(登錄號為PX004048)，利用SnapeGene3.2.1軟件設計特異性引物Px004048F(5'ATGCTGCTAATACTACTTATGC3')/Px004048R(5'TTATGCCAAAGACTCCGTTTC3')，引物均委托福州尚亞生物技術有限公司合成，以此為上下游引物。50μLPCR反應體系：2×PhantaMaxuffer25μL、cDNA模板2μ、10μmol/L上下游引物各2μL、dNTPMix1μL、PhantaMax高保真酶1μL、無核酸酶水17μL。

　　PCR反應程序：95℃預變性3.0min;95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，35個循環;72℃延伸5.0min。將PCR產物電泳后切膠回收，連接PESI載體后轉化到感受態細胞DH5α上，篩選含有pESIToll6質粒的陽性菌株送至上海鉑尚生物技術有限公司測序。利用SnapGene3.2.1軟件將所測序列與DMBDB數據庫中小菜蛾Toll6序列進行BLAST比對，將序列結果正確的菌液按1:1體積比與50%甘油混合，標記后于80℃冰箱保存備用。

　　1.2.2小菜蛾Toll6基因的生物信息學分析

　　利用ESPript3.0在線軟件，分析保守結構域。利用ExpasyTranslate在線軟件翻譯小菜蛾Toll6基因的核酸序列，獲得相應氨基酸序列。利用SingnalP5.0信號肽預測工具預測信號肽。利用SMART在線軟件分析小菜蛾Toll6蛋白的結構域。使用ExPASyProtParam在線軟件預測小菜蛾Toll6蛋白的分子量和等電點。利用MEGA10.0.5軟件，采用鄰接法構建小菜蛾Toll6蛋白氨基酸序列的系統發育樹，使用1000次重復的自舉抽樣法評估系統發育樹分支的可靠性(Kumaretal，201)。

　　1.2.3小菜蛾各發育階段及各組織中Toll6的表達分析

　　小菜蛾各發育階段及各組織的樣本采集：分別收集小菜蛾卵200粒、1齡幼蟲50頭、2齡幼蟲30頭、3齡幼蟲10頭，4齡幼蟲、蛹和成蟲各2頭，于80℃冰箱保存備用，每個發育階段重復3次。

　　分別收集30頭小菜蛾4齡幼蟲的中腸、脂肪體、血淋巴，于80℃冰箱保存備用，每個組織重復3次。實時熒光定量PCR檢測：按照RNA提取試劑盒說明書提取小菜蛾不同發育階段和不同組織樣本的RNA，按照FastKing一步法反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以此為實時熒光定量PCR模板。利用Oligo7軟件在線設計特異性引物Toll6qPCRF(5'CTGGCGGATTACAGGCAAATC3')/Toll6qPCRR(5'GAGCTAGACACACCATGAGAACAAC3')，以小菜蛾核糖體蛋白基因PxylRPL32(GenBank登錄號為AB180441)為內參基因，并以PxylRPL32F(5'CAATCAGGCCAATTTACCGC3')/PxylRPL32R(5'CTGGGTTTACGCCAGTTACG3')(Bautistaetal.，2009)為內參引物進行實時熒光定量PCR。

　　20μL實時熒光定量PCR反應體系：cDNA模板1μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、無核酸酶水7.05μL、GoTaq®qPCRMasterMix10μL、CXR參比染料0.15μL。反應程序：95℃預變性10min;95℃變性15s，60℃退火30s，溶解溫度60℃，40個循環。每個樣品3個生物學重復，采用2−ΔΔCT方法進行相對表達量分析(Livak&Schmittgen，2001)。

　　1.2.4小菜蛾Toll6對不同微生物侵染的響應試驗無菌飼料的配制：稱取麥胚粉7.5g、酵母粉4.0g、蔗糖2.0g、蘿卜籽0.6g、瓊脂1.2g，倒入250mL錐形瓶中，加入200µL菜籽油、1滴亞油酸、50mLddH2O，玻璃棒攪拌均勻，115℃滅菌30min。待冷卻至60℃，置于超凈工作臺內加入2mL無菌維生素混合液，搖晃均勻后，倒入90mm培養皿內，晾干后置于4℃冰箱中保存備用。

　　帶菌飼料的配制：將無菌飼料裝到250mL的錐形瓶中，置于微波爐中融化，待冷卻至60℃時加入2mL無菌維生素混合液，振蕩混勻，待溫度冷卻至瓶身觸手不燙時，分別加入終濃度為5.3×108菌體/mL的蘇云金芽胞桿菌菌株Bt8010和黏質沙雷氏菌菌株SmPXG6菌液，振蕩均勻后，倒入90mm培養皿內，晾干后置于4℃冰箱中保存備用，以加入同體積無菌水的無菌飼料為對照(CK)。

　　將2種帶菌飼料和CK切成1cm×1cm×1cm的飼料塊。隨機選取生長一致的小菜蛾3齡末幼蟲50頭，置于養蟲盒內，饑餓4h后分別用3種飼料塊飼喂，處理0、6、12、18、24h后，每個處理隨機選擇小菜蛾4齡幼蟲3頭，液氮處理后于80℃冰箱保存備用。利用實時熒光定量PCR檢測不同樣品中Toll6基因的相對表達量，反應體系及程序同1.2.3，每個處理重復3次。

　　此外，處理0h與12h時，每個處理隨機選取30頭小菜蛾4齡幼蟲，進行中腸解剖，將其置于組織RNA穩定保存液中，于80℃冰箱中保存備用，利用實時熒光定量PCR檢測不同樣品中Toll6基因的表達，熒光定量PCR反應體系及程序同1.2.3，每個處理重復3次。

　　1.2.5小菜蛾Toll6重組蛋白的表達和純化重組表達載體的構建：在得到的小菜蛾Toll6基因開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)的基礎上，設計1對帶有NcoⅠ和NotⅠ酶切位點的小菜蛾Toll6基因成熟肽特異性引物Toll6ORFF(5'CATGCCATGGGTAGTGGGGGTTTACACC3')/Toll6ORFR(5'ATTTGCGGCCGCTGCCAAAGACTC3')。

　　將擴增片段連接到pET28b載體上，重組質粒pET28bToll6經熱激轉化轉入到含pGTf2質粒的大腸桿菌感受態BL21(DE3)中，構建重組工程菌，篩選陽性克隆的菌液PCR產物送至上海鉑尚生物技術有限公司測序，利用SnapGene3.2.1軟件將所測序列與小菜蛾Toll6基因的克隆序列進行BLAST比對，對序列結果正確的菌液進行誘導表達。

　　菌液PCR反應體系：菌液1μL、10μmol/LT7通用上下游引物各1μL、2×HieffPCRMasterMix12.5μL、無核酸酶水9.5μL。PCR反應程序：95℃預變性3.0min;95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，20個循環;72℃延伸5.0min。

　　1.3數據分析

　　使用SPSS21軟件對試驗數據進行統計分析，采用LSD法對小菜蛾不同發育時期及不同組織中PxToll-6基因的表達量及Toll6蛋白的結合能力進行差異顯著性檢驗，采用獨立樣本t檢驗法對不同處理之間小菜蛾Toll-6基因的表達量進行差異顯著性檢驗。

　　2結果與分析

　　2.1小菜蛾

　　Toll-6基因的克隆及生物信息學分析通過PCR克隆得到小菜蛾的Toll-6基因序列(GenBank登錄號為MW446554)，全長2313bp，編碼770個氨基酸，預測Toll6蛋白的等電點和分子量分別為6.04kD和87.5kD。多序列比對和SMART軟件分析表明該氨基序列包含1個由1~16位氨基酸組成的信號肽、1個跨膜結構域和1個Toll與白介素1受體同源(Toll/interleukin1receptorhomologous，TIR)結構域、3個富含亮氨酸重復序列(leucinerichrepeats，LRR)結構域以及1個典型富含亮氨酸重復序列亞家族(leucinerichrepeats,typicalsubfamily，LRRTYP)結構域，屬于保守型序列。系統發育分析顯示，鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的Toll受體在進化樹上形成3個獨立的分支，其中鱗翅目與雙翅目昆蟲的Toll受體親緣關系較近，在鱗翅目昆蟲中小菜蛾Toll6與大債避蛾EumetajaponicaToll6的親緣關系最近。

　　3討論

　　本研究從小菜蛾基因組中成功克隆到Toll-6基因，其編碼的氨基酸序列具有典型Toll受體家族特征——LRR胞外區、跨膜區和TIR胞內區，與果蠅、家蠶Bombyxmori、意大利蜜蜂Apismellifera等昆蟲的Toll受體有相似的結構特點(Hoffmann&Reichhart，2002;Sunetal.，2017;Aronstein&Saldivar，2005;Chengetal.，2008)。家蠶Toll受體的胞外LRR結構域負責Toll受體與多肽的高親和力結合(Chengetal.，2008)，含有LRR結構域的CD14蛋白通過直接與細菌脂多糖結合參與巨噬細胞對入侵細菌的先天免疫反應(Hailmanetal.，1994;Kobe&Deisenhofer，1995)。

　　此外，在許多與發育和先天免疫反應相關的基因中均存在TIR結構域，它可以與下游接頭分子上相應區域相互作用，進而激活通路中下游元件發揮作用(孫佩璐等，2019)。因此推測小菜蛾Toll6蛋白胞外LRR結構域可能與細菌的脂多糖和肽聚糖等結合，而其胞內TIR結構域則通過與下游接頭分子互作參與小菜蛾的先天免疫反應。此外，小菜蛾Toll6蛋白含有一個1~16位氨基酸組成的信號肽，推測其可能屬于分泌蛋白。系統發育分析表明小菜蛾Toll6蛋白與大債避蛾EumetajaponicaToll6蛋白親緣關系最近，推測它們可能在先天免疫反應中發揮著類似的功能，鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的Toll受體在進化樹上形成3個獨立的分支，表明Toll受體在不同目中具有保守性。

　　本研究結果顯示，Toll-6基因在小菜蛾成蟲期表達量最高，究其原因可能是成蟲活動環境復雜，接觸病原物的機會更多，小菜蛾通過提高其體內Toll-6基因表達水平來應對病原物的入侵。此外，Toll-6基因在小菜蛾4齡幼蟲中的表達量僅次于成蟲期，其原因可能是處于暴食期的4齡幼蟲在大量攝取食物的同時接觸各種病原物的概率大大增加，小菜蛾同樣需要較高表達Toll-6基因來應對病原物的入侵。

　　中腸是小菜蛾重要的免疫器官，其內存在Toll、免疫缺陷(immunedeficiency，IMD)和Janus激酶信號轉導和轉錄激活因子(Januskinasesignaltransducerandactivatoroftranscription，JAKSTAT)等復雜多樣的免疫通路，參與小菜蛾先天免疫反應(Linetal.，2018)。本研究結果顯示Toll-6基因在小菜蛾4齡幼蟲中腸中表達量最高，表明Toll-6基因很可能作為Toll信號通路中的一員參與調節小菜蛾中腸先天免疫應答。Lunaetal(2002)研究結果表明Toll-9基因在岡比亞按蚊Anophelesgambiae成蟲中腸中高表達，其可能參與抵抗入侵病原物的先天免疫反應，與本研究結果一致。本研究發現小菜蛾Toll-6基因既可以響應革蘭氏陰性細菌又可以響應革蘭氏陽性細菌。

　　家蠶中腸Toll基因既可以響應大腸桿菌又可以響應金黃色葡萄球菌(Wuetal.，2010a，b)，與本研究結果相似;而果蠅Toll基因只響應革蘭氏陽性細菌和真菌(Buchonetal.，2014;曾令瑜等，2019)，表明小菜蛾和家蠶的Toll基因可能與果蠅的Toll基因在功能上存在差異。小菜蛾Toll-6基因對不同微生物的侵染具有不同的響應，經蘇云金芽胞桿菌菌株Bt8010刺激6h后，Toll-6基因表達被顯著抑制，表明蘇云金芽胞桿菌可能通過抑制Toll-6基因的表達來逃避小菜蛾的免疫防御反應。

　　本研究中所使用的重組小菜蛾Toll6蛋白是通過大腸桿菌系統表達的，因此在研究其功能時，無法絕對排除由大腸桿菌宿主本身產生的殘留細菌對蛋白的影響，后續研究中可以通過在大腸桿菌系統中表達一個已知無菌結合能力的其他蛋白，經過同樣純化后將其作為對照來排除這種影響，或者使用RNA干擾、規律成簇間隔短回文序列(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)及其相關Cas9蛋白介導的新一代基因編輯技術等進行體內基因敲除，與體外試驗相互驗證，從而明確該蛋白的功能。

　　參考文獻(References)

　　AronsteinK,SaldivarE.2005.CharacterizationofahoneybeeTollrelatedreceptorgeneAm18wanditspotentialinvolvementinantimicrobialimmunedefense.

　　Apidologie,36(1):314BautistaMAM,MiyataT,MiuraK,TanakaT.2009.RNAinterferencemediatedknockdownofacytochromeP450,CYP6BG1,fromthediamondbackmoth,Plutellaxylostella,reduceslarvalresistancetopermethrin.InsectBiochemistryandMolecularBiology,39(1):3846

　　BuchonN,SilvermanN,CherryS.2014.ImmunityinDrosophilamelanogaster:frommicrobialrecognitiontowholeorganismphysiology.NatureReviewsImmunology,14(12):796810

　　作者：張姍姍1,2賈元虹1,2李金洋1,2林俊涵1,2,3尤民生1,2*夏曉峰1,2*

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