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摘要：人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有無限增殖、自我更新和全能分化的特性。無論在體內還是體外環境，人胚胎干細胞都能分化為機體幾乎所有類型的細胞基于其全能分化性，胚胎干細胞成為治療各種退行性疾病的理想細胞來源。然而，在目前培養條件下所建立的胚胎干細胞株，仍然存在動物源性物質潛在污染的問題。因此，更優化的建株及培養條件十分重要。
關鍵詞：人胚胎干細胞(hESC);內細胞團;飼養層細胞;培養條件;mTESRl
人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESCs)是從早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有無限增殖、自我更新和全能分化的特性，基于這些特性，胚胎干細胞可以被廣泛地利用于個體發育研究、藥物藥理、干細胞移植治療等多個領域。尤其是胚胎干細胞移植治療方面，被認為是治療由于細胞退化及功能喪失所導致的多種退行性疾病的最有前景的治療手段。1998年美國Thomson實驗室建立起第一株人胚胎干細胞，同年，SHAMBLOTT小組從人原生殖嵴細胞及腸系膜細胞中分離出多能干細胞，以后的十幾年中，雖然人胚胎干細胞的建株及維持培養條件不斷地改進，但仍然沒有解決異源性物質潛在污染的問題，最優化的培養條件的建立對于干細胞研究的發展以及最終的臨床應用都是極其重要的。在此，本文從不同方面總結了在人胚胎干細胞建株和維持培養條件上所取得的進步。
1經典的建株和維持培養方法與存在的問題
經典的胚胎干細胞建株的方法是基于小鼠胚胎干細胞建株與維持培養方法的基礎上的，采用免疫外科學的方法，用Tyrode's液去除透明帶，用動物抗人抗體與囊胚的滋養層細胞結合，清洗并添加不含抗體的培養基，然后利用動物血清使滋養層細胞溶解，從而得到內細胞團(inner cellmass，ICM)，繼而將ICM轉移到以小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)或者永生的MEF(STO line)怍為飼養層細胞(feeder cell)的條件中培養，最終得到胚胎干細胞。建立起來的胚胎干細胞株具有以下幾個方面的特點：1)具有無限增殖的能力及自我更新、自我修復的能力，且在增殖過程中能夠保持核型的穩定性;2)細胞表達全能性基因;3)無論在體內還是在體外環境中，都能分化成為機體所有類型的細胞。自此后的許多年，人們一直延用這種建株及維持培養的方法，但是這種方法有其不可避免的弊端，傳統的培養辦法中采用小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層細胞，同時在培養基中包含了一些動物源性的成分，這些外源性成分會對人胚胎干細胞造成潛在的污染，使其存在應用的風險。
2建株的細胞來源及細胞分離方法的發展情況
2.1干細胞的來源
傳統的方法通過獲得ICM，繼續培養來建立胚胎干細胞株。有研究人員采用將已經建成的人胚胎干細胞與體細胞融合以及利用孤雌生殖的方法來獲得囊胚，繼而從中獲得胚胎干細胞，這種方法所獲得的細胞，由于染色體數目上的異常，并不是理想的方法。人們也嘗試從桑葚期的胚胎和已經停止發育的胚胎中獲得胚胎干細胞，但是由于建株成功率太低(1.5%)，也不能成為有效的辦法。采用類似于植入前診斷(preimplantationgenetic diagnosis，PGD)的方法，Chung等通過顯微操作的手段，從處于8細胞期的胚胎中取出單卵裂球，與親輩胚胎共培養后，轉移到培養皿中培養，以期使具體的個體可以有遺傳背景完全一致的全能干細胞，并成功建立起胚胎干細胞株。然而，沒有一個被取出單卵裂球的胚胎繼續發育成為一個完整的個體，使得這種方法不能被廣泛地應用。有學者利用體細胞核移植(somatic cellnuclear transfer，SCNT)技術，將已經建立起來的胚胎干細胞的細胞核移植到卵細胞內，繼續培養至囊胚后從中分離內細胞團建株，但是，利用這種方法并沒有建立起胚胎干細胞株。為了獲得疾病特異性的多能干細胞，有學者通過逆轉錄病毒載體轉染和基因重編程的方法，使得已經是終末分化的體細胞重新具有干細胞的特性，這就是我們所熟悉的誘導多功能干細胞(induced pluripotent stemcell，iPS)。這種方法建立起來的iPS株具有一定的優勢，由于體細胞是取自接受移植治療患者本人，這就最大程度避免了異體移植有可能產生的移植排斥反應，成為了獲得干細胞的另一重要來源。
2.2內細胞團的分離方法
第一株人胚胎干細胞的分離過程中，使用了動物抗人抗體及動物血清等動物源性的成分，由于這些動物源性成分可能對人胚胎干細胞造成潛在的污染，使得用這種方法建立起來的人胚胎干細胞株在后期的應用中存在風險。利用機械法直接分離囊胚的透明帶以及滋養層細胞來獲取ICM或用酶消化的方法去除透明帶從而分離ICM，在一定程度上避免了ICM與動物源性成分的直接接觸，從未來的使用方面來說是比較理想的分離1CM的辦法。此外，通過利用激光束在透明帶上打孔，在顯微鏡下，利用固定針固定囊胚，用活檢針將囊胚從透明帶中取出，之后，直接將取出的囊胚在培養皿中培養，或再利用激光束將ICM與滋養層細胞進一步分離，再在培養皿中培養，這種方法也是一種可行的方法。也有學者采用將單卵裂球與已經建成的干細胞共培養的方法來獲得胚胎干細胞，但這種方法建株的效率不高。
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