谷子 SiPSY1 基因與米色形成相關性分析

所屬分類：電子論文閱讀次時間：2021-11-12 16:42

本文摘要：摘要：為明確谷子八氫番茄紅素合成酶基因與谷子米色形成的相關性，本研究從黃色和白色 2 種不同米色谷子中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全長序列，并進行生物信息學分析，同時，利用實時熒光定量 PCR 方法檢測該基因在谷子米色形成過程中的表達模式。結果表明，SiPSY1

　　摘要：為明確谷子八氫番茄紅素合成酶基因與谷子米色形成的相關性，本研究從黃色和白色 2 種不同米色谷子中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全長序列，并進行生物信息學分析，同時，利用實時熒光定量 PCR 方法檢測該基因在谷子米色形成過程中的表達模式。結果表明，SiPSY1 基因編碼序列(CDS)全長為 1 248 bp，共編碼 415 個氨基酸。 SiPSY1 蛋白的理論分子量為 46􀆰 866 kDa，等電點為 8􀆰 97，為不穩定親水性蛋白。該蛋白的二級結構由 α 螺旋(57􀆰 35%) 、不規則卷曲(29􀆰 64%) 、延伸鏈結構(9􀆰 88%)和 β 轉角(3􀆰 13%)四種結構組成。 SiPSY1 蛋白與玉米 ZmPSY1 的同源性較高，二者的親緣關系較近。在谷子米色形成的初期和中期，黃色米色品種籽粒中 SiPSY1 基因的表達水平顯著高于白色米色品種，而在米色形成后期，該基因在白色米色品種中的表達水平顯著提高，并高于在黃色米色品種中的表達水平。隨著籽粒成熟米色的形成，SiPSY1 基因在黃色米色品種七月黃中的表達量呈先上升后顯著下降的趨勢，在白色米色品種中呈逐漸上升的趨勢。通過對 SiPSY1 基因結構和表達特性的分析，初步推測谷子米色差異及形成與 SiPSY1 基因結構無關，而與基因的表達特性有一定的相關性。本研究結果為進一步闡明 SiPSY1 基因的功能以及谷子米色形成的分子機制奠定了基礎。

　　關鍵詞：谷子; 米色; SiPSY1 基因; 基因克隆; 表達模式

分子材料論文

　　類胡蘿卜素是一種天然色素，常積累于高等植物花、果實的成色母細胞中，使其表現出黃色、紅色或橙色。此外，類胡蘿卜素也是某些植物根和種子中的重要色素[1] 。

　　類胡蘿卜素在植物光合作用及光保護作用中具有重要作用[2-3] ，在增強人體免疫、延緩衰老、預防心血管慢性疾病以及防癌抗癌方面也具有重要功效[3-5] 。類胡蘿卜素作為重要的功能性成分受到廣泛關注。目前，類胡蘿卜素生物合成途徑已基本明確，是類異戊二烯代謝體系中的一個分支，過程包括縮合、脫氫、環化、羥基化以及環氧化反應[6] 。

　　在類胡蘿卜素生物合成途徑中，多種酶發揮關鍵作用，其中，八氫番茄紅素合成酶( phytoene synthase， PSY)是第一個限速酶，可催化兩分子牻牛兒基牻牛兒基二磷酸 (geranylgeranyl diphosphate， GGPP ) 產生第一個類胡蘿卜素分子———八氫番茄紅素[6-8] 。研究者已利用cDNA 3′ 末端快速擴增技術 ( rapid amplification of cDNA 3′ ends， 3′ RACE ) 、逆轉錄 - 聚合酶鏈反應 ( reverse transcription⁃polymerase chain reaction， RT⁃ PCR) 等技術在玉米[9] 、擬南芥[10-11] 、番茄[12] 、油菜[13] 、小麥[14] 、枸杞[15] 、甘薯[16] 、雞爪槭[17] 等植物中分離克隆了 PSY 基因，對基因的序列特征開展了一系列生物信息學分析[18-19] ，并通過超表達載體的構建對該基因在多種植物中的功能進行了研究，獲得了一些具有特殊顏色的轉基因植物，如胚呈橙黃色的轉基因油菜[20] 、胚乳呈金黃色的“金大米” [21]等。

　　谷子[ Setaria italica( L.) Beauv] 是我國北方重要的雜糧作物，去殼后的小米具有較高的營養價值，深受消費者的青睞，而米色是評價小米品質的重要指標。小米中富含類胡蘿卜素，平均含量為 1􀆰 2 mg·kg-1 ，是玉米的 2 倍[22] 。從不同米色品種的小米中提取黃色素，并進行成分分析，發現米色與類胡蘿卜素的成分及含量具有一定的相關性[23-24] ，但目前關于米色形成的分子機制仍不明確，且對控制谷子類胡蘿卜素生物合成關鍵酶基因及其功能的研究較少。

　　基于此，本研究以不同米色谷子為試驗材料，分離克隆了 SiPSY1 的 cDNA 全長，通過對基因結構以及該基因在谷子米色形成過程中表達特性差異的分析，初探 SiPSY1 基因與谷子米色形成的相關性，以期為進一步開展谷子類胡蘿卜素調控機制的研究以及明確谷子米色形成分子機制提供理論依據。

　　1　材料與方法

　　1􀆰 1　材料種植及取材

　　選擇黃色(七月黃、三變黃)和白色(白谷白米谷、白米糙)2 種不同米色品種的谷子為試驗材料，材料均為山西農業大學玉米研究所谷子課題組收集的農家種，種植于山西農業大學玉米研究所試驗田，試驗田肥力均勻，地勢平坦。采用隨機區組試驗設計，設置 3 次重復。行長 3 m，行距 40 cm，三行區。取材時，各品種每個重復選擇中間行 3 株生長一致健康植株的籽粒進行混合，用鑷子快速準確地剝下相同灌漿狀態下的籽粒，在液氮中速凍后于-80℃低溫保存。 3 個取樣時期分別為：S1(米色形成初期，胚乳呈粉狀) ，S2(米色形成中期，胚乳質地硬化) ，S3(米色形成后期，籽粒成熟) 。

　　1􀆰 2　總 RNA 提取和 cDNA 合成將低溫保存的籽粒取出，去殼后置于液氮中研磨成粉末，參照 EZ-10 Total RNA Mini⁃Preps Kit RNA 提取試劑盒(上海生工生物) 說明書提取籽粒總 RNA， RNA 濃度及質量分別通過 Nanodrop 2000c 超微量核酸蛋白測定儀(美國賽默飛)和 1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。 cDNA 合成按照 M⁃MuLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒(上海生工生物) 說明書的步驟進行，獲得的 cDNA 利用內參引物進行 PCR 擴增驗證。

　　1􀆰 3　引物設計參考玉米 ZmPSY1 基因序列，在谷子基因組數據庫中查找同源性最高的基因序列，分別以 cDNA 和 CDS 序列為模板，利用 Primer 5 軟件設計克隆引物和定量引物，其中 SiActin 是內參基因。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

　　1􀆰 4　 PCR 擴增及測序以上述獲得的谷子籽粒 cDNA 為模板，PCR 擴增 SiPSY1 基因 cDNA 全長。采用 50 μL 反應體系，PCR 程序為：95℃預變性 2􀆰 5 min;95℃變性 15 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 個循環;72℃ 延伸 10 min 后 4℃保存。利用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離 PCR 產物，使用膠回收試劑盒對目標片段進行回收后送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

　　1􀆰 5　生物信息學分析利用 DNAMAN 軟件進行序列開放閱讀框的翻譯、同源性比對以及系統進化樹的構建，通過 ProtParam 網站進行蛋白質理化特性分析，分別采用 SOPMA 和SWISS⁃MODEL 在線網站預測蛋白質二級結構和三級結構，應用 MultAlin 網站進行多序列比對。

　　1􀆰 6 　實時熒光定量 PCR ( quantitative real⁃time PCR， qRT⁃PCR) 使用 SGExcel FastSYBR qPCR 預混液(含 ROX) 試劑盒進行 qRT⁃PCR，采用 50 μL 反應體系：25 μL 2× SGExcel FastSYBR Mixture(含 ROX) ， 2 μL cDNA，上、下游引物(10 μmol·L-1 )各 1 μL，最后加入 RNase⁃Free ddH2O 至 50 μL。

　　使用 CFX96 TouchTM熒光定量 PCR 檢測系統 ( 美國伯樂) ，反應程序為： 95℃ 預變性 3 min;95℃變性 5 s，60℃ 退火 20 s，40 個循環。每個反應設置 3 次技術重復。采用 2 -ΔΔCT 法，通過 Bio⁃RadCFX Manager 3􀆰 1 軟件計算基因相對表達量。利用 SPSS 17􀆰 0 軟件進行統計學分析。

　　2　結果與分析

　　2􀆰 1　 SiPSY1 基因的克隆與序列差異分析

　　以黃色和白色 2 種不同米色谷子為材料，提取籽粒總 RNA，進一步反轉錄成 cDNA，以 cDNA 為模板，通過 PCR 擴增獲得了約 1 500 bp 的目標片段。將產物送至公司進行測序，對不同品種 SiPSY1 基因的編碼序列(coding sequence， CDS)進行比對，發現該基因序列在不同品種間無差異，說明其在不同品種中編碼相同的氨基酸。利用 DNAMAN 軟件對基因序列進行翻譯，結果表明 SiPSY1 基因 CDS 全長為 1 248 bp，共編碼 415 個氨基酸。

　　2􀆰 2　 SiPSY1 基因生物信息學分析

　　2􀆰 2􀆰 1　蛋白質理化性質分析利用 ProtParam 在線分析 SiPSY1 的氨基酸序列，結果表明其理論分子量為 46􀆰 866 kDa，等電點為 8􀆰 97，分子式為 C2072 H3308 N592 O605 S21 ，構成該蛋白的氨基酸中，亮氨酸含量最高，占 11􀆰 6%，其次為丙氨酸和精氨酸，均占 9􀆰 9%，組氨酸含量最低，僅為 0􀆰 5%。不穩定系數為 62􀆰 61，屬于不穩定蛋白。其親水性平均系數 ( grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0􀆰 284，屬于親水性蛋白。

　　2􀆰 2􀆰 2　蛋白質結構預測利用 SOPMA 網站在線預測 SiPSY1 蛋白質的二級結構，結果表明，該蛋白質由 α 螺旋(238 個氨基酸殘基，占 57􀆰 35%) 、不規則卷曲(123 個氨基酸殘基，占 29􀆰 64%) 、延伸鏈結構 (41 個氨基酸殘基，占 9􀆰 88%)和 β 轉角(13 個氨基酸殘基，占 3􀆰 13%)構成。通過 SWISS⁃MODEL 網站獲得了 SiPSY1 蛋白質的三級結構模型，與二級結構預測結果基本一致。

　　2􀆰 2􀆰 3　同源序列與系統進化分析利用 DNAMAN 軟件對克隆獲得的谷子 SiPSY1 氨基酸序列與 NCBI GeneBank 中其他植物的 PSY1 氨基酸序列進行比對，分析了它們的同源性和進化關系。

　　谷子 SiPSY1 編碼氨基酸與多種植物 PSY1 編碼氨基酸具有同源性，有多個保守區域，其中，與玉米 ZmPSY1 的同源性最高，達到 84􀆰 77%，其次為水稻 OsPSY1，同源性為 77􀆰 5%，與小麥 TaPSY1 的同源性為 73􀆰 86%，此外，與擬南芥 AtPSY1、辣椒 CaPSY1 的同源性相同，均為 62􀆰 95%，與番茄 SlPSY1、木薯 MePSY1 和油菜 BnPSY1 的同源性相同，為 62􀆰 73%。基于以上多重序列比對結果，進一步構建了系統進化樹，結果表明，谷子 SiPSY1 與玉米 ZmPSY1 的親緣關系最近，與另外 2 個禾本科作物水稻和小麥的 PSY1 親緣關系次之，而與其他植物的 PSY1 親緣關系較遠。

　　2􀆰 3　 SiPSY1 基因在不同谷子品種米色形成過程中的表達特性分析通過 qRT⁃PCR 的方法，測定分析了 SiPSY1 基因在不同米色谷子品種中的表達差異以及在谷子米色形成過程中表達水平的變化情況，。

　　SiPSY1 基因在谷子籽粒中的相對表達量存在品種差異，具體表現為，在米色形成初期( S1)和中期( S2) ，SiPSY1 基因在 2 個黃色米色品種中的表達水平均顯著高于在白色米色品種中的表達水平。在米色形成后期( S3) ， SiPSY1 基因在 2 個白色米色品種中的表達水平，高于在黃色米色品種中的表達水平。在谷子米色形成過程中，SiPSY1 基因在黃色米色品種七月黃中的相對表達量表現為先上升后顯著下降的趨勢，在三變黃中呈下降趨勢，但 3 個時期的變化并不顯著。而在 2 個白色米色品種中，SiPSY1 的相對表達量均表現為逐漸上升的趨勢，其中，在白谷白米谷米色形成后期( S3) ，表達量顯著升高，在白米糙米色形成各時期的變化均達到顯著水平。

　　3　討論

　　在植物類胡蘿卜素生物合成途徑中，兩分子 GGPP 在八氫番茄紅素合成酶( PSY)作用下生成第一個類胡蘿卜素分子———八氫番茄紅素。 PSY 作為第一個限速酶，其編碼基因成為研究類胡蘿卜素生物合成機制以及利用基因工程技術提高植物類胡蘿卜素含量的首選目的基因[25] 。

　　目前，在多種植物中已經成功克隆分離出 PSY 基因，并鑒定出 PSY 基因家族中的 3 個成員，分別為 PSY1、PSY2 和 PSY3，3 個基因具有器官或質體表達特異性。其中，PSY1 主要在含有有色體的花、果實和種子中調控類胡蘿卜素的合成[25-28] 。本研究以不同米色谷子品種籽粒為研究材料，利用同源克隆技術，獲得了谷子 SiPSY1 基因的 cDNA 全長，其開放閱讀框( open reading frame， ORF) 包含 1 248 個堿基，共編碼 415 個氨基酸。谷子 SiPSY1 蛋白與同屬于 C4 禾本科作物玉米的 ZmPSY1 同源性最高，為 84􀆰 77%，二者親緣關系最近。

　　4　結論

　　本研究從黃色和白色兩種不同米色谷子籽粒中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全長序列，該基因的 CDS 全長為 1 248 bp，共編碼 415 個氨基酸。通過 qRT⁃PCR 分析表明，在谷子米色形成初期和中期，SiPSY1 基因在黃色米色品種籽粒中的表達水平顯著高于白色米色品種，由此推測谷子 SiPSY1 基因的表達特性與谷子米色形成具有一定的相關性。

　　參考文獻：

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　　[ 2 ]　朱運欽，喬改梅，王志強. 植物類胡蘿卜素代謝調控的研究進展 [ J]. 分子植物育種， 2016， 14(2) ： 471-474

　　[ 3 ]　吳園園，于玉鳳，王怡惠. 植物類胡蘿卜素合成代謝調控機制研究進展[ J]. 植物學研究， 2020， 9(3) ： 217-225

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　　[ 6 ]　霍培，季靜，王罡，關春峰. 植物類胡蘿卜素生物合成及功能 [ J]. 中國生物工程雜志， 2011， 31(11) ： 107-113

　　作者：禾璐1，2 賈蘇卿1 趙芳玉1 劉晶2 張彬2 侯思宇2 韓淵懷2，∗