西瓜果實形狀的分子精準鑒定

　　摘要：為了實現西瓜果實形狀的分子精準鑒定，利用“國家西瓜甜瓜中期庫”的資源和高通量測序平臺，利用兩個不同的雜交分離群體(F2和BC1P1)分別鑒定到一個159bp插入缺失和一個非同義SNP導致的果形突變(由圓果形變為長果形)，且SNP突變在159bp插入缺失的基因組區域內。利用這個SNP開發CAPS標記Markersun在兩個群體和28份西瓜種質中進行分析，發現標記Markersun在兩個群體中與果形表型共分離;在西瓜種質中可同時區分插入缺失和SNP的變異，且與果形表型共分離。同時這兩個變異與果形的共分離在196份西瓜核心種質的基因型分型中也得到驗證。此外，通過對不同類型西瓜種質的基因型分析發現，SNP變異導致的長果形出現的時間更早且獨立遺傳，而159bp插入缺失引起的長果形是栽培西瓜馴化過程中產生的。本研究首次利用不同類型的西瓜核心種質實現了西瓜果形的分子精準鑒定，還挖掘到兩個西瓜果形的功能變異并開發標記，為西瓜果形的分子精準鑒定提供技術支撐，同時為果形性狀基因功能驗證提供靶標，加速了西瓜果形性狀基因的調控機理研究。

　　關鍵詞：西瓜;果形;功能分子標記;核心種質;精準鑒定

　　果實形狀是瓜果類園藝作物的重要性狀，同時也是產品分類、定級與評價的重要指標。前人研究發現番茄的果形主要由個基因SUN、OVATE、LOCULENUMBER(LC)和FASCIATED(FAS)調控(Rodriguezetal.，2011;Monforteetal.，2014)，黃瓜和甜瓜中與控制番茄果形的SUN同源的基因CsSUM和CmSUN14也是控制果形的關鍵基因(Panetal.，2017)。

　　西瓜種植論文范例：小蘭西瓜早春無公害設施栽培技術

　　西瓜果實形狀有圓形和非圓形(橢圓和長)，受顯性單基因控制(Weetman，1937;Poole&Grimball，1945)。受環境及栽培條件影響，橢和長的界限模糊，難以區分，但圓與二者的區別很大，因此筆者在本文中將橢圓和長統稱長。前人利用不同遺傳背景的西瓜材料在號染色體的相同區域穩定檢測到一個果形主效QTL(Sandlinetal.，2012;Liuetal.，2016;Douetal.，2018;Guoetal.，2019;Legendreetal.，2020)，并在QTL區域發現SUN的同源基因Cla011257。同時開發了一些分子標記，包括個InDel(Douetal.，2018)和個SNP(Legendreetal.，2020)。

　　因所用的材料有限，有關西瓜果形的關鍵遺傳變異和遺傳進化至今尚不清楚。分子標記輔助選擇是利用與目標性狀基因緊密連鎖或表現共分離的分子標記進行選擇的一種方法，但由于分子標記與目的基因之間的連鎖不夠緊密使得遺傳交換在所難免，性狀預測的準確率難以達到預期(Fuetal.，2017);并且育種中常用的分子標記大多位于基因間非表達序列，無法區別與其連鎖基因的表達序列的差異。而功能分子標記源于控制目標性狀基因的功能變異(Kageetal.，2016)，對基因的選擇更為有效，并且功能標記的應用還可以更好地避免連鎖累贅，減少供體不利基因向受體導入。

　　功能分子標記已在一些作物，如水稻(Jietal.，2010;Zhouetal.，2013)、小麥(Periyannanetal.，2014)、玉米(Azmachetal.，2013)、大豆(Liuetal.，2014)等得到應用，但園藝作物的功能分子標記甚少。為挖掘影響西瓜果形的功能變異并實現果形性狀的分子精準鑒定，本研究結合深度重測序和簡化基因組測序，利用不同類型的西瓜骨干親本構建和BC分離群體，分別定位西瓜果形性狀的QTL并挖掘關鍵的遺傳變異，開發標記并在群體和核心種質中進行驗證，為西瓜果形分子標記輔助育種提供技術支撐，同時加速西瓜果形性狀基因的調控機理研究。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料與群體構建

　　用于基因定位的第套群體是利用圓果形栽培西瓜品系‘ZXG01478’為母本，長果形栽培西瓜品系‘14CB11’為父本，雜交獲得，進一步自交獲得含有93個單株的群體(Shangetal.，2016);父母本、和群體的各個單株在2013年秋季種植，分別自交留種并于成熟期調查果實形狀等數據。第套群體是利用圓果形栽培西瓜品系‘B100’為母本，長果形栽培西瓜品系‘B136’(已驗證與長果形西瓜品系‘14CB11’不同)為父本，雜交獲得，進一步與母本‘B100’回交獲得含有93個單株的BC群體;父母本、和BC群體各單株在2017年春季種植，分別自交留種并于成熟期調查果實形狀等數據。另有調查鑒定果形的128份西瓜種質(李娜等，2020)包括份缺須西瓜、份藥西瓜、30份野生西瓜、21份黏籽西瓜和69份普通西瓜。所有材料均按常規方法種植。

　　1.2性狀調查與數據分析

　　果實形狀、果實長度、果實寬度、果形指數的性狀調查方法參照項目組的標準方法進行(李娜等，2020)。卡方測驗和相關性分析分別利用SASV8的Freq和corr程序進行。

　　1.3QTL定位與連鎖分析

　　利用包含2634個SNP標記的遺傳連鎖圖譜(Shangetal.，2016)和表型數據進行QTL定位。QTL掃描采用WinQTLcartographer2.5軟件(http：//statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)的復合區間作圖法(compositeintervalmapping，CIM)。基于標準模型Model6，余因子的選擇采用前后回歸相結合(forwardbackwardstepwiseregression)的方法(Pin=0.05和Pout=0.05)。

　　背景標記數、窗口大小、掃描間距和運行速度分別設為、10cM、5cM和1cM。QTL顯著性的閾值用1000次的排布測驗(Churchill&Doerge，1994)確定。采用=0.05的顯著性水平來確認QTL。新開發的分子標記和連鎖群上其他SNP標記運用JoinMap4.0軟件(http：//www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap)構建遺傳連鎖圖譜。軟件參數設置：擬合度閾值≤，最大重組率0.4，最小LOD為2.0，作圖函數選擇Kossambi函數。

　　1.4標記開發

　　對個親本材料利用IlluminaHiSeqTM2500進行約20×深度的重測序，參考基因組為全基因組測序的西瓜品種‘97103’(Guoetal.，2013)。SNP和InDel的檢測主要使用GATK軟件工具包(McKennaetal.，2010)實現。利用自編的Perl程序提取插入缺失相應位置前后500bp的序列。利用Primer5.0軟件(Clarke&Gorley，2001)設計對應InDel的引物對。利用在線分析軟件dCAPSFinder2.0(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)(Neffetal.，2002)和Oligo7軟件設計CAPS引物(SNP轉化)并選擇常用價廉的限制性內切酶。

　　1.5基因型鑒定與數據分析

　　西瓜葉片的DNA提取采用改良的CTAB方法，PCR的擴增按照常規方法進行，對PCR產物進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀。PCR產物直接利用其引物由北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger測序。重測序數據的直觀查看利用IGV(IntegrativeGenomicsViewer)軟件包。

　　2結果與分析

　　2.1西瓜果實形狀基因定位

　　群體的母本‘ZXG01478’為圓果形，果實長度、果實寬度、果形指數分別為(17.25±0.35)cm、(16.50±1.13)cm、1.05±0.05。父本‘14CB11’為長果形，果實長度、果實寬度、果形指數分別為(26.00±1.50)cm、(16.17±1.04)cm、1.61±0.07。趨向于長果形，果實長度、果實寬度、果形指數分別為(25.55±1.48)cm,(17.00±1.84)cm、1.51±0.08，更接近于父本。群體93個單株的果實長度、果實寬度和果實指數的頻率分布圖呈現正態或近似正態分布。群體中長果形的70個，圓果形的23個，基本符合3:1的分離比(χ=1.04，=0.31)，表明果形受個顯性基因控制。相關性分析表明，果實長度與果形指數顯著正相關(r=0.91，<0.0001)，果實寬度與果形指數呈現負相關(r=–0.45，<0.0001)，而果實長度和果實寬度無顯著的相關性(r=–0.07，=0.534)。

　　2.3西瓜種質果實形狀的精準鑒定

　　利用Markersun的引物在128份西瓜種質中進行PCR擴增，并用限制性內切酶TagI進行酶切。可以明確顯示159bpInDel和SNP的變異。主帶有種帶型，259bp(，果形為長)，151bp和108bp兩條帶(，果形為圓)，100bp(，果形為長)，且存在AB、BC的雜合帶，表型皆為長果形，與果形的顯性基因結果一致。標記Markersun在種質中的基因型鑒定結果與表型性狀(表)完全吻合。

　　利用項目組進行的196份西瓜核心種質(本試驗所用128份包含在內)重測序獲得的SNP變異發現，有159bp缺失的長果形種質在號染色體的26847041bp位置為缺失(未知序列)，而其他的種質基因型分為兩類，即參考基因組基因型和突變SNP基因型，且與果實形狀表型完全共分離，這與利用標記Markersun分析的結果完全一致。

　　查考候選基因Cla011257及其上、下游5kb的基因組區域的SNP和小的InDel，除了這個SNP(Chr6：26847041)，其他的變異與果實形狀皆無顯著的相關性。因此，推測這個SNP和159bpInDel都可導致候選基因Cla011257功能發生改變從而使西瓜果形由圓變為長。

　　野生西瓜中的長果形西瓜全部是SNP變異引起;而普通西瓜中的長果形部分是SNP變異引起，部分是159bpInDel引起，說明SNP變異導致的長果形出現的時間更早并獨立遺傳，而159bpInDel引起的長果形西瓜是栽培西瓜馴化過程中產生的。

　　3討論

　　Cla011257屬于SUN基因家族成員，是西瓜果形的候選基因(Douetal.，2018;Legendreetal.，2020)。已有研究表明，SUN在其他園藝作物中控制果實長度和果形，如番茄、甜瓜和黃瓜(Xiaoetal.，2008;Monforteetal.，2014;Perpinaetal.，2016;Panetal.，2017)等。

　　Dou等(2018)發現長果形的西瓜候選基因Cla011257存在個159bp的缺失，導致53個氨基酸的缺失，可能導致其功能發生改變，開發的InDel標記在分離群體中得到驗證。Legendre等(2020)利用份不同果形的西瓜材料，對候選基因Cla011257進行測序和變異分析，發現個159bpInDel和個SNP，并開發KASP標記在分離群體中進行驗證。上述研究僅在幾份不同果形材料及其后代分離群體中進行驗證，有限的資源數使得對西瓜果形的進化和馴化難以窺見全貌。

　　本研究中，首先針對性的構建果形相關群體，挖掘與果形性狀相關的候選基因和關鍵遺傳變異。值得關注的是，在果形基因Cla011257的第個外顯子區域發現個159bpInDel和一個非同義SNP在兩個群體中分別與表型共分離。利用128份西瓜種質對開發的功能分子標記進行驗證，標記基因型和果形表型完全共分離。全部196份西瓜核心種質的重測序結果也證實這個SNP和InDel共同解釋核心種質100%的表型變異。

　　在資源繁殖更新和數據調查過程中發現，搜集到的有限幾份野生近緣種諾丹西瓜、缺須西瓜、熱迷西瓜、藥西瓜都是圓果形，半野生種質黏籽西瓜全部是圓果形，而野生西瓜和現代栽培種質既有圓果形，又有長果形。通過分析發現，野生西瓜種質中的長果形全部是SNP突變導致，而現代栽培西瓜中的長果形部分是SNP突變導致，部分是159bp的缺失導致。因此推測，這個SNP在早期進化時期出現并在馴化的過程中獨立遺傳，而159bpInDel在栽培西瓜的馴化過程中出現。

　　至此，推測位于候選基因Cla011257第個外顯子上的這個非同義點SNP突變和159bpInDel皆可導致基因功能發生改變從而使得果形由圓形變為長形。本研究通過西瓜分離群體和核心種質的分析，獲得兩個獨立遺傳的功能變異(個SNP和個InDel)與果形性狀共分離，基本實現了西瓜果形的分子精準鑒定，為西瓜果形的定向育種提供技術支撐和理論指導，并為后續關鍵變異和功能基因的驗證提供靶標，加速了果形性狀基因的調控機理研究。

　　作者：李娜，尚建立，李楠楠，周丹，孔勝楠，王吉明，馬雙武

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