抗菌肽在動物養殖中的研究進展

　　摘要：抗菌肽是飼料添加劑中最有潛力的替抗產品之一。利用基因工程菌生產抗菌肽產量高、成本低、耗時短，是實現抗菌肽大規模生產的最佳方案。文章綜述幾種能夠生產抗菌肽的表達系統以及抗菌肽在動物養殖中的應用，旨在為抗菌肽發展的方向提供參考。

　　關鍵詞：抗菌肽;基因工程;飼料添加劑

　　抗菌肽是由生物體產生的能夠快速抵抗致病性微生物的天然抗生素，在宿主防御中起著重要作用[1]。抗菌肽可以從不同的生物體中被分離出來，包括動物、植物、細菌和真菌[2-4]。抗菌肽數據庫(APD)已經收錄3000多種天然抗菌肽[5]。抗菌肽通過改變膜的通透性[6]、抑制代謝[7-8]以及調節免疫反應[9]等途徑到達抑菌效果，且不易產生耐藥性。

　　在替抗的大環境下，抗菌肽以其獨特的優勢成為當今最有潛力的飼料添加劑之一。抗菌肽的生產方式可以分為3種：從生物體上分離提純[10-11]、化學合成[12]和生物合成[13]。上述3種方式均可以獲得抗菌肽，但存在著產量低、耗時長、成本高等問題。如果需要進行大規模生產，利用基因工程進行生物合成是較好的選擇。一些細菌和真菌均可以作為生產抗菌肽的宿主菌，文章對幾種能夠生產抗菌肽的表達系統以及抗菌肽在動物養殖中的應用進行綜述。

　　畜牧師評職知識：畜牧獸醫業績成果包括什么

　　1原核表達系統

　　1.1大腸桿菌表達抗菌肽大腸桿菌是常見的原核表達系統，其遺傳背景清晰、繁殖迅速，能夠高效穩定地表達外源基因，產生有生物活性的蛋白產物。目前，有很多抗菌肽在大腸桿菌中成功表達的研究[14]。抗菌肽的分子量小，不易分離和提純，可將同一種抗菌肽基因串聯表達，增加分子量;或者將抗菌肽與其他蛋白串聯起來[15-16]。但是，利用大腸桿菌表達抗菌肽也存在一定的弊端。抗菌肽對大腸桿菌存在一定的傷害，可能會導致細胞死亡;大腸桿菌細胞內的酶會降解抗菌肽;在抗菌肽的分泌過程中可能會有包涵體的產生等。

　　1.2枯草芽孢桿菌表達抗菌肽枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，是一種用于大規模生產重組蛋白的替代表達系統。枯草芽孢桿菌表達系統優勢為該菌耐熱、不產內毒素和外毒素、有很好的發酵基礎[17]。枯草芽孢桿菌是一種綠色的飼料添加劑，具有改善腸道功能，提高動物免疫力的優點[18]。Li等[19]成功將一種從蜂蜜中提取出的抗菌肽abaecin在枯草桿菌中表達，并且達到抑菌效果，說明枯草桿菌表達系統可以作為生產抗菌肽的一種強有力的工具。但與大腸桿菌表達系統相比，枯草芽孢桿菌的表達載體、質粒以及產物表達過程均存在著不穩定性，這些問題還需亟待解決[17]。

　　1.3地衣芽孢桿菌表達抗菌肽地衣芽孢桿菌能夠促進腸道有益菌的生長，多用在水產養殖，對弧菌的抑制作用較佳[20]。通過基因工程改造地衣芽孢桿菌在產酶上已經得到一些成果，但是通過表達外源基因生產抗菌肽的相關報道較少。2009年，有研究人員提出將細菌素基因轉入地衣芽孢桿菌中表達[21]。2014年，華中農業大學成功構建出一株高產地衣素的地衣芽孢桿菌，優化培養基后最高產量達2149mg/L(比親本菌種提高16.8倍)[22]。雖然本身存在著一定優勢，但是地衣芽孢桿菌并未成為生產抗菌肽的一種基因工程菌，利用地衣芽孢桿菌還存在一定難度。

　　1.4乳酸菌表達系統

　　乳酸菌可以調節腸道菌群平衡，提高生產性能。乳酸菌的產酸能力強，可以充當飼料中的酸化劑[23]。乳酸菌自身可以分泌出各種抗菌肽來抑制病原菌的生長，最多見的是細菌素。細菌素可以作為防腐劑和抗菌劑在市場上應用，但是不具有廣譜抑菌性[24]。開發具有廣譜活性的新型細菌素成為關注的重點。研究人員從乳酸菌中分離出幾種新型細菌素和非核糖體抗菌肽，以上幾種抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用[25]。乳酸菌的研究熱點集中在如何從中分離出新型抗菌肽[26-27]，而不是讓其表達外源基因。這一點可能是由于相較于其他的表達系統，乳酸菌的遺傳背景和生物學信息不夠清晰，在分子操作上存在一定的難點。

　　2真核表達系統

　　2.1畢赤酵母表達抗菌肽與原核生物表達系統不同，真核系統對蛋白質有一定的修飾作用，可以避免產生無生物活性的產物。畢赤酵母是優選的真核表達系統，能夠使用甲醇作為其唯一的碳源，基因中含有由甲醇誘導的AOX1啟動子可以實現基因的高水平表達[28]。與其他的真核表達系統相比，利用畢赤酵母表達外源基因，生產蛋白類物質更容易分泌到細胞外。例如，利用畢赤酵母表達抗菌肽NZX，在5L發酵罐中進行120h的誘導，產物收率可達965mg/L，純度為92.6%[29]。利用畢赤酵母實現大規模生產的局限性在于畢赤酵母的強啟動子AOX1需要利用甲醇誘導，甲醇使得生產安全性大大降低。目前，大多使用不需要進行甲醇誘導的組成型啟動子。

　　2.2釀酒酵母表達抗菌肽在飼料中添加釀酒酵母培養物能夠起到增加飼料適口性、增大采食量、提高動物的抵抗力的作用。利用釀酒酵母表達抗菌肽的優勢在于安全性。目前，通過釀酒酵母表達抗菌肽，并實現大量生產的實例較少，因為釀酒酵母表達系統存在糖基化嚴重的問題，會導致大量蛋白失活。但是，也有一些研究展現出釀酒酵母表達抗菌肽的潛力，如菌絲霉素[30]、牛乳鐵蛋白肽[31]以及一些報道較少的抗菌肽[32]均實現了在釀酒酵母中的成功表達。

　　3抗菌肽在動物養殖中的應用

　　3.1抗菌肽在水產養殖中的應用邱繼新等[33]研究發現，日糧中添加100mg/kg蠅蛆抗菌肽，飼喂56d后，鳙魚餌料系數降低16.56%，成活率提高10%，表明添加蠅蛆抗菌肽可以有效促進鳙魚生長，降低養殖成本。董曉慶等[34]研究發現，添加200mg/kg抗菌肽時，鯉魚生長狀態良好，有利于蛋白質、鈣、磷的積累。使用抗菌肽浸泡虹鱒苗種，通過對相關免疫酶以及體表細菌的觀察，發現抗菌肽浸泡能夠提高虹鱒苗種的免疫力，減少體表細菌滋生，大大提高幼魚成活率[35]。

　　3.2抗菌肽在反芻動物養殖中的應用抗菌肽可以作為幼齡山羊的飼料添加劑，添加抗菌肽可以提高瘤胃木聚糖酶、果膠酶和脂肪酶的活性;也可以提高乙酸、丙酸和總揮發性脂肪酸的濃度，有助于山羊的生長[36-37]。楊顏銥[38]研究表明，復合抗菌肽“態康利保”可以增強川中黑山羊細胞、體液免疫應答。陳蕓等[39]研究表明，添加復合抗菌肽可以降低山羊瘤胃變形菌門和螺旋菌門的相對含量，提高部分降解纖維菌屬的含量，并且瘤胃菌群結構多樣性不受復合抗菌肽的影響。柳涵等[40]研究發現，抗菌肽可以明顯提高奶牛產奶量，對奶牛隱性乳房炎也有一定的防治效果[41]。

　　3.3抗菌肽在家禽養殖中的應用張磊[42]研究表明，抗菌肽能夠提高海蘭褐蛋雞產蛋后期的產蛋率，改善雞蛋的營養成分。益生菌與抗菌肽的復合優于單獨使用[43]。王建[44]研究發現，將抗菌肽Api-PR19添加到肉雞日糧中，肉雞腸絨毛組織結構得到改善，腸道有害菌的數量減少，肉雞的生長性能得到改善。張江等[45]研究發現，添加微生態制劑和抗菌肽復合物可以提高櫻桃谷鴨的成活率。

　　3.4抗菌肽在豬養殖中的應用梁秀麗等[46]研究發現，抗菌肽B-13可以改善初生仔豬小腸形態，提升盲腸微生物菌群多樣性和豐富度。劉又銘等[47]研究表明，抗菌肽對由脂多糖引起的仔豬消化性能降低有明顯的改善作用。袁威等[48]研究表明，抗菌肽在提高斷奶仔豬生長性能和其免疫力等方面具有良好的效果。黃榮春[49]研究表明，抗菌肽可以顯著增加仔豬出生重、平均產活仔數、平均產健仔數和健仔率。

　　4展望

　　利用原核表達系統生產抗菌肽的優勢在于繁殖快、培養周期短、表達抗菌肽易于分離純化;與真核表達系統相比的劣勢在于無法進行蛋白質的進一步修飾以及難以抵抗抗菌肽對自身的傷害。較為常用表達系統，如大腸桿菌和畢赤酵母，兩者均已經具備成熟的操作手段，并且均已經取得了不錯的成果。枯草芽孢桿菌、乳酸菌以及釀酒酵母由于其本身的安全性，同樣具有發展潛力。抗菌肽作為飼料添加劑，在改善動物腸道菌群、維持腸道健康、提升動物免疫力等方面有積極作用。但單一的抗菌肽產品并不能完全代替抗生素，還需要和其他的替抗產品復配。對于不同的動物來說，抗菌肽的添加量需要通過進一步的試驗來確定。

　　參考文獻

　　[1]孫得發，肖發沂，都振玉，等.抗菌肽在畜牧養殖中的應用與研究進展[J].現代畜牧獸醫，2020(6)：59-64.

　　[2]GuangshunW.Database-guideddiscoveryofpotentpeptidestocombatHIV-1orsuperbugs[J].Pharmaceuticals,2013,6(6):728-758.

　　[3]DubosRJ.StudiesonabactericidalagentextractedfromasoilBacillus:I.Preparationoftheagent.Itsactivityinvitro[J].Exp.Med.,1939,70:1-10.

　　[4]SteinerH,HultmarkD,EngströmA,etal.Sequenceandspecificityoftwoantibacterialproteinsinvolvedininsectimmunity[J].Nature,1981,292:246-248.

　　[5]WangZ,WangG.APD:Theantimicrobialpeptidedatabase[J].NucleicAcidsRes.,2004,32:590-592.

　　[6]Barreto-SantamaríaA,RiveraZJ,GarcíaJE,etal.ShorterantibacterialpeptidehavinghighselectivityforE.colimembranesandlowpotentialforinducingresistance[J].Microorganisms,2020,8(6):867.

　　[7]Flórez-CastilloJM,Rondón-VillarealP,Ropero-VegaJL,etal.IbM6antimicrobialpeptide:AntibacterialactivityagainstclinicalisolatesofEscherichiacoliandmoleculardocking[J].Antibiotics,2020,9(2):79.

　　[8]LeeB,HwangJS,LeeDG.AntibacterialactionoflactoferricinBlikepeptideagainstEscherichiacoli:Reactiveoxygenspecies-inducedapoptosis-likedeath[J].JournalofAppliedMicrobiology,2020,129(2):287-295.

　　作者：張雨陳鵬

轉載請注明來自發表學術論文網：http://www.zpfmc.com/nylw/27633.html