本文摘要：[摘要]目的識別冠心病(CHD)的差異表達基因(DEGs)，通過分析DEGs參與的生物學途徑闡明CHD疾病發(fā)生涉及的細胞內通路。方法從GEO數據庫下載兩個已發(fā)表的CHD微陣列數據集中mRNA表達芯片的原始數據。篩選DEGs并對其進行生物信息學分析，包括Venn分析、基因本體(GO)注釋分析
[摘要]目的識別冠心病(CHD)的差異表達基因(DEGs)，通過分析DEGs參與的生物學途徑闡明CHD疾病發(fā)生涉及的細胞內通路。方法從GEO數據庫下載兩個已發(fā)表的CHD微陣列數據集中mRNA表達芯片的原始數據。篩選DEGs并對其進行生物信息學分析，包括Venn分析、基因本體(GO)注釋分析、KEGG(KyotoEncy-clopediaofGenesandGenomes)細胞通路富集分析、蛋白質相互作用(PPI)網絡分析。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)驗證CHD病例外周血中核心DEGs的表達水平。結果共篩選出122個CHD的DEGs。GO及KEGG分析顯示，這些DEGs參與了DNA轉錄和mRNA剪接調控。PPI網絡分析顯示，表達下調基因LUC7L3、HNRNPA1、SF3B1、ARGLU1、SRSF5、SRSF11、SREK1、PNISR、DIDO1、ZRSR2和NKTR位于網絡中心，且這些基因均為DNA轉錄和RNA剪接相關基因。RT-qPCR檢測證實以上基因在CHD中均表達下降，與前期芯片結果一致。結論RNA剪接在CHD的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用。
[關鍵詞]冠心病;基因表達;計算生物學;RNA剪接
心血管疾病是目前世界上人類死亡的主要原因之一。冠心病(CHD)是最常見的一種心血管疾病，在全球范圍內每年導致超過700萬人死亡[1]。2014年的一項研究顯示，近1/5的男性和1/10的女性死于CHD[2-4]。據估計，未來20年CHD患病率將增加約10%[5]。CHD已成為威脅人類健康的重要疾病之一，對CHD發(fā)病機制及有效療法的研究和探索從未停止。CHD的主要危險因素包括血脂異常、糖尿病、動脈硬化、肥胖、吸煙、久坐的生活方式、壓力、年齡、男性和家族病史等[6]，但其具體發(fā)病機制尚不完全清楚。既往研究顯示，遺傳因素在心血管疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮了極大的作用[7]。
CHD發(fā)生的生物學機制有多種，其中研究較為清楚的為炎癥反應，炎癥反應失調是CHD發(fā)生的一種潛在的生物學機制[8]。相關研究表明，基因表達差異，尤其是炎癥調控相關基因表達異常與CHD的發(fā)生緊密關聯[9]。除了炎癥異常調控外，還有其他因素的變化參與CHD的發(fā)生。本研究旨在通過對GEO數據庫中CHD發(fā)生的基因表達譜進行生物信息學分析，揭示與CHD疾病發(fā)生相關的生物學過程及信號通路，為進一步闡明CHD的發(fā)病機制提供有價值的信息，并為CHD的診斷、治療提供新的思路。
1資料和方法
1.1基因微陣列數據收集CHD樣本的基因表達芯片來自GEO數據庫[10-12]。以“CoronaryHeartDisease”為關鍵詞在GEO數據庫中進行檢索，最終在210個相關數據集中選取2個來自AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array分析平臺的基因集GSE71226及GSE19339，共包含7個CHD樣本和7個正常樣本的表達矩陣。
1.2原始數據預處理及差異表達基因(DEGs)鑒別
下載原始數據，采用R語言(affy，limma包)對其進行噪聲去除、分位數歸一化等處理，然后篩選CHD組和正常對照組的DEGs。篩選DEGs的閾值設定為P值<0.05，且|log2(Foldchange)|≥1。最后，采用R語言(pheatmap包)對基于mRNA表達水平的組樣本進行可視化層次聚類分析。
1.3GSE71226和GSE19339中共有差異表達基因
(co-DEGs)的Venn分析通過DrawVennDiagram線上數據庫對GSE71226和GSE19339數據集中的co-DEGs進行分析[13-15]。將待分析基因列表上傳到數據庫，即可顯示維恩圖及相關共有基因列表。
1.4基因本體(GO)和基因通路富集分析
GO注釋分析通常用于大規(guī)模轉錄組數據的功能研究。KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)包含了多種生物化學通路。將待分析基因列表上傳至DAVID生物信息學資源6.8數據庫[16-17]，即可顯示GO及KEGG分析結果，將其下載為文本文件。最后，通過R語言(ggplot2包)可視化GO結果。
1.5基因集富集分析(GSEA)
將特定規(guī)格的矩陣表格加載到GSEA_4.0.2軟件，通過GSEAonline進行可視化即可完成GSEA分析[18-19]。DEGs途徑富集的閾值為P值<0.01。1.6蛋白質調控網絡分析
DEGs的蛋白質相互作用(PPI)網絡分析通過STRING在線分析軟件完成[19-20]。將基因列表上傳到多個蛋白質分析菜單欄，稍后即可顯示PPI結果。最后用Cytoscape軟件將具體的網絡圖可視化。
1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)驗證
CHD病人核心DEGs的表達水平取青島市市立醫(yī)院心臟外科10例50～80歲CHD病人和10例同齡健康人的外周血樣本，使用高效血液總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，Lot#DP443)提取總RNA。用Oligo(dT)引物(Takara，cat#3806，Lot#T2301AA)在65℃條件下退火5min得到mRNA，用RevertAid逆轉錄酶(ThermoScientific，#EP0441)和dNTP混合物(Takara，Cat#4019，Lot#AI11312A)進行逆轉錄得到cDNA模板。最后使用PowerTrackSYBRGreenMasterMix(ThermoScientific，#4367659)及基因特異性引物進行RT-qPCR，檢測目的基因的相對mRNA水平。
2結 果
2.1CHDDEGs的篩選
從GEO數據庫中收集了7例CHD病人和7例正常對照者的mRNA表達譜。根據|log2(Foldchange)|≥1、P值<0.05的篩選條件，GSE71226數據集中共鑒定出2262個DEGs，其中包含上調基因694個及下調基因1568個;GSE19339數據集中共鑒定出537個DEGs，其中包含上調基因263個及下調基因274個。對這些DEGs進行熱圖聚類分析結果顯示，CHD組和正常對照組的基因表達模式差異顯著。
由于樣本來源不同(GSE71226數據集中樣本來自CHD病人和正常人的外周血;GSE19339數據集中樣本分別來自經皮冠狀動脈介入治療的CHD病人冠狀動脈閉塞部位的血管和正常人外周血)，兩個數據集中分析得到的DEGs具有一定差別。而且，兩個數據集中病人信息極少，故無法分析年齡、性別和病史對CHDDEGs的影響。
2.2co-DEGs的Venn分析
為了較為精確地研究CHD的DEGs，本研究分析了GSE71226和GSE19339兩個數據集中的co-DEGs。結果篩選得到兩個數據集中共同上調基因8個及共同下調基因114個，共計122個co-DEGs。兩個數據集中大部分co-DEGs均為表達下調基因，提示這些共同下調基因可能是CHD發(fā)病的關鍵基因。
2.3CHDco-DEGs的GO和KEGG分析
為了闡明DEGs的生物學功能，對以上122個co-DEGs進行了GO富集分析。結果顯示，CHD中大多數的co-DEGs參與的生物學過程(biologicalprocess)為mRNA加工和剪接調控、細胞內轉錄調控;co-DEGs所屬的細胞成分(cellcompo- nents)為核質、細胞核和細胞質;其分子功能(molecularfunctions)主要為poly(A)RNA結合、蛋白結合、DNA結合。KEGG富集分析顯示，大多數co-DEGs顯著富集的信號通路為剪接體。以上分析結果表明，CHD的發(fā)生與細胞整體蛋白質表達調控紊亂或RNA剪接紊亂具有重要關聯。
2.4CHDDEGs的GSEA分析
為了進一步分析CHDDEGs可能參與的信號通路，本研究對其進行了GSEA分析。結果顯示，兩個GEO數據集中DEGs共同低表達的基因富集的信號通路為mRNA過程的調節(jié)及DNA損傷修復(DNAdamagerepair)。表明CHD發(fā)生過程中，涉及mRNA調節(jié)過程及DNA損傷修復途徑的相關基因表達水平下降。GSEA分析結果與GO分析結果相一致。
2.5CHDDEGs的蛋白質調控網絡分析
為了篩選CHD的關鍵DEGs，本研究對122個co-DEGs進行了PPI分析。結果顯示，兩個數據集共同下調的基因大部分處于PPI網絡中間，而共同上調的基因則處于網絡邊緣。其中，位于PPI網絡中心的基因分別為LUC7L3、HNRNPA1、SF3B1、ARGLU1、SRSF5、SRSF11、SREK1、PNISR、DIDO1、ZRSR2及NKTR。提示這些基因的異常低表達可能在CHD的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。2.6CHD關鍵DEGs分析篩選出的11個關鍵DEGs在CHD中均顯著低表達。GO分析結果顯示，這些關鍵DEGs涉及的生物學過程為DNA轉錄和RNA剪接體調控。表明CHD的發(fā)生與RNA剪接異常調控具有重要關系。
2.7RT-qPCR驗證
CHD關鍵DEGs的表達分別收集10例CHD病人及10例正常人的外周血，對篩選出的關鍵DEGs的表達水平進行了RT-qPCR驗證。結果顯示，CHD病人外周血中這些DEGs的表達水平均較正常人顯著下調。
3討 論
盡管對CHD進行了40多年的基礎和臨床研究，但其具體發(fā)病機制仍不完全清楚。通過分析CHD發(fā)生過程中涉及的生物學途徑，增加對CHD發(fā)病機制的了解，可為CHD的臨床治療及預后判斷提供新思路。剪接體被證明是一種蛋白質定向金屬酶[21]。
作為真核細胞中最復雜的調控機制之一，剪接體從初級轉錄本中去除內含子序列，生成功能性mRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)[22]，這一過程稱為選擇性剪接。選擇性剪接是一個動態(tài)且受調控的生物學過程，受到一系列變量的影響，如順式調控序列和反式作用因子、轉錄過程和DNA/RNA的甲基化等[23-24]。多項研究表明，異常可變剪接與人類疾病有關，它既可能是疾病的發(fā)生原因，也可能是疾病造成的結果[25]。
有研究結果表明，參與剪接體正常功能的基因突變被認為是脊髓性肌萎縮、色素性視網膜炎和普瑞德-威利綜合征等的關鍵因素[26-28]。然而，剪接因子中導致人類心臟病變的突變并不多見。到目前為止，只有剪接因子RNA結合基序蛋白20(RBM20)的突變被證實與心臟病有因果關系[29-31]。此外，相關研究結果表明，與RNA剪接相關基因在心臟病中異常表達。例如，剪切因子SF3B1在患病的人和小鼠心臟中均表達上調[32]，Rbfox1基因在人類和小鼠心臟中表達下調[33]。然而，CHD病 人中DEGs一直未被明確闡述。
本研究分析了GEO數據庫的GSE71226和GSE19339數據集中CHD病人的基因表達數據，擬篩選與CHD發(fā)生密切相關的DEGs，探討CHD基因水平的發(fā)病機制。結果顯示，1.118%～2.954%(GSE71226：2.954%;GSE19339：1.118%)的基因表達水平上調，同時有1.165%～6.667%(GSE71226：6.667%;GSE19339：1.165%)的基因表達水平下調，表明CHD的發(fā)生與細胞中基因表達的變化密切相關。
由于樣本來源和各微陣列平臺研究都存在差別，綜合分析各種微陣列數據集可以獲得更為準確的結果，故選擇了兩個數據集中8個共同表達上調基因及114個共同表達下調基因進行進一步分析。GO注釋分析結果表明，這些DEGs參與了DNA轉錄和mRNA剪接調控，提示CHD的發(fā)生與細胞中RNA剪接紊亂有關。選擇性剪接是一種可實質上改變基因表達模式的轉錄后機制。高達95%的人類基因具有多外顯子可變剪接形式，表明可變剪接是人類基因組功能復雜性的最重要組成部分之一。
本研究結果表明，大部分的CHDDEGs是可變剪接相關的基因，提示可變剪接調控在心臟病的研究中應受到更多的重視。綜上所述，本文結果顯示，CHD病人RNA剪接相關基因的表達水平發(fā)生顯著改變，表明RNA剪接調控在CHD的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用，但其在CHD中的具體作用機制仍有待進一步研究。本研究結果為CHD的進一步研究及高危人群的篩查提供了新的思路。
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作者：李召水1，王光靜2，喬友進2，生偉2，黃強2，池一凡1
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