醫學論文雜志淺析原發性肝癌組織

所屬分類：醫學論文閱讀次時間：2015-05-17 11:16

本文摘要：【摘要】【目的】優化雙向凝膠電泳的實驗步驟，總結出一套適用于原發性肝癌組織的雙向凝膠電泳技術�！痉椒ā� 對雙向電泳實驗中的關鍵環節：樣本處理、上樣方法、聚焦條件等進行研究與優化，考馬斯亮藍染色后進行凝膠圖像比較。【結果】采用7 mmol /L尿

　　【摘要】【目的】優化雙向凝膠電泳的實驗步驟，總結出一套適用于原發性肝癌組織的雙向凝膠電泳技術�！痉椒ā� 對雙向電泳實驗中的關鍵環節：樣本處理、上樣方法、聚焦條件等進行研究與優化，考馬斯亮藍染色后進行凝膠圖像比較。【結果】采用7 mmol /L尿素、2 mol /L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol /L DTT、5 g/L (pH 3-10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF作為裂解液，丙酮沉淀蛋白，主動水化上樣法，聚焦電壓達到140 kV可以得到分辨率高、重復性好的結果。【結論】上述改良提高了2-D圖譜中蛋白位點的分辨率和重復性，為原發性肝癌組織的蛋白質組學研究奠定了基礎。

　　【關鍵詞】原發性肝癌; 蛋白質組學; 雙向電泳

　　原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，死亡率在我國惡性腫瘤中位居第二[1]。蛋白質組學是研究腫瘤發生機制[2]，尋找腫瘤標志物的重要工具，對于肝癌發生機制和治療作用靶點的研究具有重要意義[3]。我國早在2003年就啟動了人類肝臟蛋白質組計劃(HUPO)，并取得了一定的研究成果。但關于肝癌組織雙向電泳的技術卻少完整系統的報道，為了建立高分辨率可重復的肝癌組織雙向凝膠電泳技術，我們對人肝癌組織的雙向電泳技術中的關鍵環節進行了研究對比，優選出一套適合肝癌組織的雙向凝膠電泳方法，供從事肝臟蛋白質組學雙向電泳的技術人員參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 標本采集

　　原發性肝癌組織來自我院肝癌切除術患者。組織離體后立即以預冷PBS沖洗，在冰上分裝置入凍存管，液氮中速凍，后轉入-80 ℃冰箱中保存備用。所有病例均經術后病理證實為原發性肝細胞癌。

　　1.1.2 試劑

　　丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)、尿素、十二烷基硫酸鈉(SDS)、3-[3-(膽酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、甘氨酸、IPG緩沖液(pH 3 ～ 10)、蛋白酶抑制劑、碘乙酰氨(IAA)、硫脲、18 cm 膠條(pH 3 ～ 10 NL)均為Amersham公司產品。TCA、丙酮為Sigma公司產品。無水乙醇為國產分析純(廣州化學試劑廠)，所有溶液均用去離子水配制。

　　1.1.2 主要設備

　　Immobiline Dry Strip，Ettan IPG 3等電聚焦電泳儀，Ettan DALT six 600 垂直電泳槽，Imagescanner高密度掃描儀，ImageMaster軟件均購自Amersham公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 蛋白質樣品制備

　　粗樣本制備：取肝癌組織100 mg，液氮冷凍研磨，加入0.5 mL裂解液(含10 g/L PMSF蛋白酶抑制劑)，裂解液(7 mmol/L尿素、2 mol/L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol/L DTT、50 g/L(pH 3 ～ 10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF)，超聲裂解，15 ℃，離心10 min，取上清液，4 ℃，超速離心50 min，避開漂浮的脂質層，吸取離心上清4 ℃，再次離心50 min;取上清。Bradford法定量，分裝后置-80 ℃保存。為充分去除樣本中含有的雜質對等電聚焦的影響，我們采用了常用的三種蛋白沉淀方法，并對結果進行對比。①丙酮沉淀蛋白：加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20 ℃沉淀至少2 h，4 ℃，離心15 min，用裂解液重溶。 ②三氯乙酸/丙酮沉淀：將三氯乙酸加到提取組織液中，終質量濃度為100 g/L，再加入4倍體積的冰丙酮使蛋白在-20 ℃沉淀至少2 h， 4 ℃離心15 min，最后再用冰丙酮清洗沉淀，去除三氯乙酸，用裂解液重溶。③Cleaning-up試劑盒沉淀蛋白：按Amersham公司的試劑盒說明書操作，用裂解液重溶。

　　1.2.2 等電聚焦電泳

　　分別采取目前常用兩種上樣方法：標準膠條槽上樣(主動水化)及杯上樣(被動水化)，并對結果進行比較分析。聚焦程序參考聚焦系統操作指南，同時利用軟件對聚焦電壓，電流進行檢測，指導聚焦程序的調整，對不同聚焦方法進行比較分析(表1)。

　　1.2.3 第二向 SDS 電泳

　　(SDS-PAGE) 等電聚焦后的膠條分別以SDS平衡緩沖液(第一次加入100 mg/10 mL DTT，第二次加入250 mg/10 mL 碘乙酰胺)平衡兩次，每次15 min。平衡后IPG膠條轉移至電泳系統，用125 g/L的膠進行二向電泳，每塊膠2 W，電泳50 min后改為每塊膠15 W，電泳至溴酚藍跑到凝膠底部。凝膠進行熱考馬斯亮蘭染色。

　　1.2.4 凝膠圖像采集與分析

　　染色后凝膠以Image scanner高密度掃描儀獲取圖像，利用ImageMaster軟件對圖像進行蛋白質斑點自動檢測，然后手工刪除假點，添加未檢出的斑點，最后進行斑點匹配，分析。

　　2 結果

　　2.1 蛋白沉淀方法對電泳結果的影響

　　從圖1可見，未經處理的樣本蛋白點雖然很多(1 920點)，但分辨率很差。丙酮，TCA-丙酮，Cleaning-up 試劑盒沉淀后的樣本與原始樣本相比均有很多改善，但TCA-丙酮丟失的蛋白較多(1 644點)，丙酮(1 856點)，和Cleaning-up(1 713點)丟失的蛋白較少。圖 1B中，經TCA-丙酮沉淀后，酸性蛋白大量丟失。圖1C中，丙酮沉淀蛋白點數多且清楚，無明顯拖帶和條紋，背景干凈清晰，說明蛋白質富集和純化的效果都比較好。

　　2.2 不同聚焦條件對電泳結果的影響

　　圖2中，A聚焦電壓是80 kV，B聚焦電壓140 kV。由于聚焦時電流較高，將500 V延長2 h，1 kV延長了1 h，從圖中可見B的聚焦效果比A有很大改善。圖C是我們監測的延長低壓聚焦后(圖B)的IEF電壓走勢圖，從圖中可見電壓升至設定的80 kV進行聚焦。圖2 B蛋白點數較A明顯增多，特別是酸性端，說明B聚焦效果明顯好于A。

　　2.3 主動水化與被動水化上樣的電泳結果

　　從圖3中可看出，圖A中的蛋白點數明顯增多，點也更圓，而且沒有圖B中的橫條紋。說明主動水化比被動水化的聚焦效果更好。

　　3 討論

　　雙向凝膠電泳(2-DE)由于其在展示全部蛋白質表達改變并鑒定特異性蛋白方面的優勢，成為目前蛋白質組學研究首選的分離技術[4]，近年來得到了較大的發展與改善，但實驗結果的重復性和穩定性仍有待提高[5]。我國關于肝癌的蛋白質組學研究越來越多，由于肝癌組織成分復雜，干擾成分多，個體差異大使其雙向電泳實驗條件難以嚴格控制[6]，目前尚沒有針對該組織的雙向電泳技術的方法學的系統報道，為此，我們對肝癌組織蛋白的制備、一向聚焦程序、上樣方法等關鍵步驟進行研究對比，優化總結出一套可行的，重復性好的雙向電泳方法，供大家參考。

　　3.1 樣品制備

　　蛋白質樣品的制備是的關鍵環節，關系到蛋白質組研究結果的準確性[7]。樣本制備主要包括蛋白提取與沉淀兩個步驟。蛋白提取過程需盡可能地溶解和解聚蛋白質[8]。通常采用分級提取蛋白的方法，但是繁瑣的樣品制備步驟容易造成樣品中蛋白質組分的丟失[9]。為了盡可能減少蛋白丟失，我們采用液氮冷凍研磨的方法提取蛋白。另外，裂解液的選擇也非常關鍵[10]。目前常用的裂解液配方有兩種：第一種，7 mmol /L尿素，4%(CHAPS)，0.5%的IPG，0.1 mmol/L DTT;第二種，將8 mmol/L 尿素改為7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲[11]。后者添加了硫脲，它可以增強蛋白的溶解，特別是溶解疏水蛋白。Fialka在對小鼠乳腺上皮細胞亞細胞結構的蛋白提取中，添加了硫脲，獲得一系列的亞細胞器膜蛋白的如跨膜蛋白Ecadherin等[12]。為了盡可能得到肝癌組織的全蛋白，我們采用了含硫脲的裂解液。

　　蛋白沉淀，目前還有許多問題沒有解決，如沉淀后蛋白的溶解，特別是一些疏水蛋白、低豐度蛋白等不容易重溶，而它們可能是藥物的靶向位點，或是腫瘤細胞的表面抗原，在疾病發生過程中發揮重要的作用[13]。肝癌樣本中含有的脂肪、核酸和大量的鹽分，影響等電聚焦。鹽離子在水化過程中容易滲入膠條，使凝膠內產生不均一的電流分布，導致雙向電泳結果出現條紋和不均一背景[14]。因此，必須采用蛋白沉淀的方法去除這些雜質，才能順利地完成聚焦。目前，已有不少有關樣本沉淀的報道，最常使用丙酮沉淀法，TCA-丙酮沉淀法，和商業化的Cleaning-up kit來沉淀蛋白，但沉淀的效果如何，卻沒人做過系統的比較分析。本文將這三種沉淀方法都進行實驗，TCA-丙酮沉淀法蛋白丟失較多，與它的作用原理有關。蛋白質在 pH 值小于等電點的環境中帶上正電荷，與TCA的酸根結合生成不溶鹽而沉淀，再用丙酮將酸根完全抽提，獲得較純的蛋白質樣品[15]。因此它對堿性蛋白的富集效果較好，但對等電點小于溶液 pH 值的酸性蛋白富集效果差，有機溶劑的多次作用造成了蛋白質溶解性變差也加劇了蛋白質的丟失。圖1B中用TCA-丙酮沉淀后酸端蛋白丟失很明顯。

　　丙酮沉淀法是通過降低水的介電常數，破壞蛋白質膠體的水化層，形成沉淀析出[16]。但是，蛋白質分子在常溫或升溫時立體結構展開，丙酮極容易與其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸進行疏水結合導致蛋白變性，因此整個沉淀過程應使用預冷的丙酮[17]。Cleaning-up 試劑盒是商家進行改良后的沉淀法，也獲得了很好的電泳圖譜，但相比之下，丙酮具有經濟方便等優點，所以我們推薦使用丙酮沉淀法。

　　3.2 聚焦程序

　　一向聚焦是雙向電泳成功的關鍵，但好的聚焦程序是怎樣摸索出來的呢?我們的經驗是首先根據IEF的原則編排基礎聚焦程序;再根據樣本是否除鹽決定低壓聚焦的步驟及時間;最終的聚焦電壓以5 ～ 8 kV為適，聚焦時間以10 h為基礎進行調整。為了確保實驗的重復性，最終聚焦要選擇千伏結束。此外，在IEF過程中，利用軟件對聚焦時的電壓，電流進行實時監測，指導低壓聚焦時間及步驟的調整。如電流過高，可在低電壓處延長聚焦時間，利用低壓達到除鹽的效果。

　　3.3 上樣方法

　　一向等電聚焦最常用的上樣方法包括主動水化和被動水化。主動水化中，由于施加低電壓有利于大分子蛋白的進入膠條[18]，可避免杯上樣所產生的滲漏問題。被動水化法可任意調節上樣位置，所以特別適合偏酸或偏堿蛋白的聚焦;最高電流可達75 ?滋A，因此對鹽的耐受能力較強;同時具有避免蛋白在長時間的低電壓水化過程中丟失等優點。但有些蛋白質的等電點靠近上樣處，遷移率及溶解性降低，易沉淀在上樣杯處，在二相電泳中表現為在上樣處形成條紋狀。實驗時，應當根據樣本類型和實驗需要進行選擇。本實驗中，肝癌組織蛋白主要在pH 3 ～ 10之間，通過比較，我們選擇主動水化。

　　蛋白質組學實驗涉及的步驟很多，除了上述關鍵步驟，還有凝膠濃度，染色方法的選擇等。實驗時要根據感興趣的蛋白的分子量選擇凝膠濃度，常規選擇125 g/L的凝聚;如果大分子質量的蛋白較多可以選擇100 g/L的凝膠，相反，如果小分子質量的蛋白多，則選擇150 g/L的凝膠。常用的染色方法有考染、膠體考染、銀染、熒光染色等。一般上樣量大于300 μg時可選擇考染或膠體考染;上樣量在100 ～ 300 μg選擇銀染;小于100 μg選擇熒光染色。

　　我國肝癌組織蛋白質組學研究已有很多報道，但沒有系統的總結雙向電泳的方案。本研究充分結合肝癌組織成分特點及雙向電泳的具體要求，從雙向電泳的全過程進行探討，通過實驗獲得理想的雙向電泳圖譜，形成了一套用于肝癌蛋白質組學研究的穩定可靠的雙向電泳技術方案，供從事肝癌蛋白質組學研究人員參考，為進一步的蛋白質組學分析奠定基礎。

　　【參考文獻】

　　Bosch FX， Ribes J， Diaz M， et al. Primary liver cancer： worldwide incidence and trends [J]. Gastroenterology， 2004， 127 (5 Suppl 1)： 5-16.

　　馮作化，藥立波，周春燕. 醫學分子生物學 [M]. 北京：人民衛生出版社，2005，351-357.

　　樊嘉，王征. 肝細胞癌綜合治療 [J]. 外科理論與實踐，2006，11(6)：467-470.