對照提取物用于金銀花藥材的質量控制方法

所屬分類：醫學論文閱讀次時間：2016-06-27 17:26

本文摘要：本篇中藥材論文通過采用對照提取物辦法研究金銀花藥材的質量控制方法。一般情況下，對中藥材進行多指標含量測定，需要采用純度較高(98%以上)的對照品，由于對照品分離純化過程較為復雜，所以價格較高，給中藥生產企業造成一定的經濟負擔，不利于多批次中藥材

　　本篇中藥材論文通過采用對照提取物辦法研究金銀花藥材的質量控制方法。一般情況下，對中藥材進行多指標含量測定，需要采用純度較高(98%以上)的對照品，由于對照品分離純化過程較為復雜，所以價格較高，給中藥生產企業造成一定的經濟負擔，不利于多批次中藥材的質量控制，本文提出的采用對照提取物作為對照，建立標準曲線，可實現對金銀花藥材的多指標含量測定。

　　《天然產物研究與開發》(月刊)創刊于1989年，是由中國科學院主管、中國科學院成都文獻情報中心主辦的我國最早報道天然產物研究與開發的專業性學術刊物。辦刊宗旨：報道天然產物研究的最新成果，開發天然產物研究的廣泛用途，促進國內外學術交流，加強科研、開發、生產的進程，傳播具有戰略性、前瞻性和創新性的科技成果，以促進我國科技與經濟發展。

　　[摘要] 為解決中藥材色譜分析中對照品價格較高的問題，該文以金銀花藥材為例，提出采用對照提取物作為參考物質，對藥材進行常規分析的方法。采用對照品對對照提取物進行了標定，測定出其中6種有機酸類化合物的含量，并考察了對照提取物的長期穩定性。利用對照提取物配制不同濃度的溶液，建立了標準曲線。對11批次金銀花藥材進行分析，采用t檢驗方法對分別利用對照品和對照提取物測得的結果進行比較，結果表明二者之間不存在顯著性差異。該方法可用于金銀花藥材的質量控制，并對解決類似問題有借鑒意義。

　　[關鍵詞] 對照提取物;金銀花;質量控制;有機酸

　　多指標含量測定及指紋圖譜技術是對中藥材進行質量控制的有效手段，但面臨著對照品價格昂貴、不易獲得，從而導致分析成本較高的問題，加之目前藥典中規定的中藥材含量測定指標較少，中藥生產企業不愿在中藥原料藥材的多指標含量測定上投入更多資金，限制了該技術在中藥生產企業的推廣使用，難以實現質量標準的提高。為解決這一問題，近年來出現了“一測多評”的新型中藥材多指標含量測定方法，并被錄入藥典[1]，該技術不僅在很大程度上解決了上述問題，而且引導了相關的科研工作者探索新的中藥材質量控制方法，采用對照提取物對中藥材進行多指標質量控制就是一種新的思路。

　　金銀花Lonicera japonica Thunb.是中醫臨床常用的藥材，其中的主要化學成分包括揮發油、有機酸類化合物、黃酮類化合物和三萜皂苷類化合物[2-3]。李萍等對該藥材進行了系列研究，從中分離出多種對照品，并利用分離出的對照品建立了多個多指標含量測定方法，用于對金銀花藥材進行質量控制[4-7]。藥理實驗表明，有機酸類化合物是主要的藥效物質，主要包括綠原酸(chlorogenic acid， CA)、咖啡酸(caffeic acid， CfA)、新綠原酸(neochlorogenic acid， NCA)以及異綠原酸等，其中異綠原酸是二咖啡酰奎寧酸(dicaffeoylquinic acid， DCA)的一組同分異構體，主要包括3，4-二咖啡酰奎寧酸(3，4-DCA)、3，5-二咖啡酰奎寧酸(3，5-DCA)和4，5-二咖啡酰奎寧酸(4，5-DCA)等[8-9]，但以上化合物的純品由于制備困難，所以成本較高，不適于工廠多批次藥材的常規分析。

　　對照提取物是指化學成分及其含量較為明確、穩定性較好且純度較高的中藥提取物。其中的化學成分及其含量已經采用對照品進行標定，可配制成不同濃度的系列標準溶液，用于原料藥材中多種化學成分的含量測定[10-11]。本文利用“對照提取物”作為參考物質，對金銀花藥材進行多指標含量測定，效果滿意，進一步證實了該方法用于中藥材質量控制具有可行性。

　　1 材料

　　Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司); MILLIPORE超純水器(美國Millipore公司);KQ-250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);METTLER AE240型1/1萬電子天平(梅特勒-托利多公司);FL-027高速臺式離心機(德國Eppendorf公司)。

　　實驗用乙腈、甲酸均為色譜純，實驗用水為超純水。CA、CfA對照品購自中國食品藥品檢定研究院，NCA，3， 4-DCA，3， 5-DCA，4， 5-DCA由本實驗室自制，純度均大于95%(采用色譜峰面積歸一化方法計算而得)。金銀花對照提取物樣品由上海凱寶藥業有限公司提供。金銀花藥材購自亳州中藥材市場，經浙江大學藥學院陳柳蓉副教授鑒定為忍冬科植物忍冬L. japonica的干燥花蕾。

　　2 方法與結果

　　2.1 對照提取物的標定所用的對照提取物由上海凱寶藥業有限公司生產，為金銀花藥材經過煎煮、濃縮、醇沉、萃取等一系列的分離純化步驟后得到，6種目標成分的質量分數加和值在 60%以上。在用其作為標準參考物質之前，先采用作者所在實驗室自建的HPLC進行標定[12]，該方法采用6種有機酸對照品建立工作曲線，并進行了方法學驗證，所用色譜條件如下。Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為0.1%甲酸溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B);采用二元梯度洗脫，洗脫程序為0～25 min， 8%～8% B;25～30 min， 8%～19%B;30～60 min， 19%B;流速 1 mL·min-1;檢測波長 280 nm;柱溫 25 ℃;進樣量 10 μL。在此色譜條件下，所得混合對照品和對照提取物的色譜圖見圖1。

　　對照提取物中的6種目標成分得到了基線分離且峰形良好，可進行準確測定。利用DAD檢測器得到的化合物光譜進行各目標成分色譜峰的純度分析，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA的純度分別為 99.86%，97.89%，98.95%，99.69%，99.29%，98.79%。對批號為081207的提取物進行了標定，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA等6種有效成分的質量分數分別為 3.81%，11.29%，20.99%，4.63%，7.04%，17.02%。

　　2.2 對照提取物穩定性考察采用提取物作為標準參考物質，要求其具有滿意的穩定性，能夠在較長的時間內使用，所用的提取物第1次標定后密封，置于冰箱內冷藏，2年中共進行3次標定，結果見表1，RSD均小于3%，表明該提取物在3年內具有較為滿意的穩定性。

　　2.3 供試品溶液制備稱取1 g金銀花藥材粉末置于25 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，超聲提取2 h后，重新定容至25 mL，取提取液1 mL，1萬 r·min-1下離心10 min，取10 μL上清液用于HPLC分析，藥材提取液與提取物HPLC分析方法相同。

　　2.4 線性關系考察標定后的對照提取物實際上相當于一種“混合對照品”，可用其配制成一系列不同濃度的溶液，制定工作曲線，擬合出回歸方程，實現對藥材樣品的測定。精密稱取 50 mg對照提取物，溶解于50%甲醇中，并定容至10 mL，作為儲備液，然后逐級稀釋，制成不同濃度的溶液，按照2.1項下條件進行液相分析，并制定出標準工作曲線，6種有效成分的回歸方程見表2。

　　所建標準曲線及相關系數(R2)符合定量分析的要求，可用于供試品中6種有機酸類化合物的含量測定。

　　2.5 精密度日內精密度，按照2.3項下供試品制備方法制備供試品溶液，精密量取同1份供試品溶液，重復進樣6次，按照2.1項下色譜條件進行分析，計算6種有機酸的峰面積的RSD，見表3。日間精密度，按照2.3項下供試品制備方法制備供試品溶液，精密量取同1份供試品溶液，6日內每日進樣1次，按照2.1項下色譜條件進行分析，計算6種有機酸的峰面積的RSD，見表3。

　　2.6 穩定性按照2.3項下供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0， 2， 4， 8， 16， 24 h精密量取同1份供試品溶液10 μL，按照2.1項下色譜條件進行分析，計算6種有機酸的峰面積的RSD，見表3。

　　2.7 重復性按照2.3項下供試品制備方法，用同1批次藥材制備6份供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行分析，計算6種有機酸的峰面積的RSD，見表3。

　　2.8 加樣回收率采用加樣回收法，精密稱取已知含量的金銀花藥材1 g，加入5 mg的對照提取物，按照2.3項下供試品制備方法，制備6份平行供試品溶液。按照2.1項下色譜條件進行分析，計算6種有機酸的回收率，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA對應的回收率分別為 99.81%，95.34%，102.9%，100.6%，98.02%，96.79%，RSD分別為 3.0%，2.1%，4.2%，1.8%，2.9%。

　　2.9 金銀花藥材分析結果以上結果表明，利用對照提取物所建立的分析方法，精密度、穩定性、重復性和加樣回收率可滿足定量分析的要求，可用于金銀花藥材樣品的定量分析。分別采用對照品和對照提取物建立標準工作曲線，測定了購自亳州中藥材市場的11個批次的金銀花藥材，測定結果見表4。

　　采用配對t檢驗的方法對2種方法測得的含量進行比較，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA對應的P分別為 0.180，0.817，0.587，0.329，0.017，0.871，均大于0.05，表明二者之間不存在顯著性差異。采用OriginPro 8統計學軟件對2種方法測得的結果進行相關性分析，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA對應的相關系數分別為 0.999 5， 0.999 3， 0.990 9， 0.958 1， 0.999 0， 0.996 1，均在0.95以上。以上結果表明可采用對照提取物對金銀花藥材進行質量控制。

　　作者認為，符合對照提取物條件的物質必須具備以下3個條件：一是來源于需要進行質量控制的藥材，具有較強的針對性;二是純度較高，可知目標成分總量要占較高比例;三是穩定性較好，可供長期使用。本文對這一方法進行了初步探索，真正實現在生產企業中應用還需要相關工作者進行進一步研究。