巰基-烯點擊反應介導的生物傳感研究進展

　　摘要：巰基-烯點擊反應是一種無金屬催化的點擊反應，目前正廣泛應用于分子標記、新材料合成和材料表面功能化等方面。詳細介紹了巰基-烯點擊反應的反應機理、影響反應的因素，以及該反應介導的生物標記技術。在此基礎上，論述了巰基-烯點擊反應在生物傳感、細胞成像、納米材料的生物功能化方面的應用。最后預測了巰基-烯點擊反應在未來的發展方向和應用前景。

　　關鍵詞：巰基-烯點擊反應;生物傳感;細胞成像;功能化

　　點擊化學反應是通過碳-雜原子鍵的連接快速合成有用的新化合物的反應，由化學家Sharpless、Kolb及Finn于2001年提出后受到越來越多的關注[1]。點擊化學有以下一種或多種特征：反應快速;通量合成高;操作簡單;反應條件溫和;原料來源廣;反應產物易純化，產物得率高[1]。

　　點擊反應的有多種，包括環加成反應，親核開環反應，非醇醛的羰基化反應，碳-碳多重鍵加成反應，疊氮-膦偶合反應。狄爾斯-阿爾德反應(Diels-Alderreaction)和1，3-偶極-環加成反應(copper-catalyzedazide-alkynecycloaddition，CuAAC)屬于環加成反應;氮丙啶、環氧化物和環狀硫酸酯等發生的反應屬于親核開環反應;腙、肟醚和芳香族雜環的形成屬于非醇醛的羰基化反應;二羥基化反應和環氧化反應屬于碳-碳多重鍵加成反應;施陶丁格連接屬于疊氮-膦的偶合反應。按照是否需要金屬作為反應催化劑可以將點擊反應分為金屬催化的點擊反應和無金屬催化的點擊反應。如CuAAC為金屬催化的點擊反應，而疊氮-炔環加成反應(strain-promotedalkyne-azide cycloadditions，SPAAC)和巰基-烯點(thiol-ene)擊反應則為無金屬催化的點擊反應。

　　金屬催化的點擊反應在生物學領域的使用具有一定的限制性，因金屬離子難以被純化分離，而且具有潛在的生物毒性作用，可能會損害機體健康。因此，無金屬催化的點擊化學反應如狄爾斯-阿爾德反應、施陶丁格連接和巰基-烯點擊反應受到了廣泛的關注。在材料合成和生物分子標記中，巰基-烯點擊反應都發揮著重要的作用。巰基-烯點擊反應被廣泛的應用于生物大分子的合成如樹枝狀化合物的合成和聚合物的合成等方面。巰基-烯點擊反應還可以應用于蛋白質、核酸鏈和聚糖等生物分子的標記中。

　　另外，巰基-烯點擊反應在材料表面功能化方面也具有很重要的作用。在生物傳感方面，巰基-烯點擊反應具有非常具有廣闊的應用前景。本文對巰基烯點擊反應進行了綜述，詳細介紹了巰基-烯點擊反應的反應機理、影響反應速率的因素和生物大分子的標記。并且介紹了巰基-烯點擊反應介導的生物傳感器及與生物傳感相關的應用，包括生物功能化納米材料和細胞成像等方面。最后對巰基-烯點擊反應在生物傳感領域的發展進行了展望。

　　1巰基-烯點擊反應偶聯機理及性質

　　硫醇-烯點擊反應通常包括自由基介導的巰基-烯點擊反應和親核試劑催化的巰基-邁克爾加成反應。自由基引發的巰基-烯反應機理可以分為以下幾個步驟：首先，在加熱或光照的條件下，引發劑吸收能量被激發裂解，形成自由基;接著，形成的自由基和巰基發生反應，奪取巰基上的氫原子，觸發巰基自由基形成;然后，形成的巰基自由基和烯基發生反應，形成烷基自由基;之后，烷基自由基會進攻巰基化合物，奪取巰基上的氫原子，引發鏈增長，同時產生新的巰基自由基。這些新產生的巰基自由基可繼續和烯基反應。其中第二步產生的巰基自由基可引發鏈增長也可以發生雙基終止[2]。

　　親核試劑催化的巰基-邁克爾加成反應的反應機理包括以下步驟：硫醇與親核試劑的反應促使巰基去質子化，成為相應的硫酸鹽陰離子。硫酸鹽是一種很強的親核體，與活化的C=C加成，形成中心碳為陰離子的中間體。之后這個中間體吸收一個質子，形成巰基-烯產物[3]。近幾年，巰基-烯反應點擊化學的特性受到了人們的廣泛關注，在生物應用領域也已經擴展到交聯網絡、生物傳感以及功能化生物材料等方面。從合成的角度看，巰基-烯的反應有十分顯著的優勢，如反應速度快，應用范圍廣(不管反應物活性如何，大多數的烯烴和所有的巰基幾乎都能滿足反應條件)，基本上屬于最簡便的一種無金屬催化的點擊化學反應。

　　2巰基-烯點擊反應的影響因素

　　2.1巰基結構對反應速率的影響

　　參與巰基-烯點擊反應的巰基化合物主要有4種，包括烷基硫醇酯類、烷基(芳基)硫醇類、烷基3-巰基酯類硫醇和烷基硫醇。在巰基-烯點擊化學反應中，反應速率和巰基化合物的結構有關。含有推電子基團的巰基化合物的反應活性較高，如異丙撐基;含有吸電子基團的巰基化合物反應活性較低，如酯基。巰基-烯點擊反應的巰基化合物的反應活性由小到大分別為硫苯酚類、烷基硫醇酯、烷基3-巰基酯類硫醇和烷基硫醇。

　　2.2烯類單體結構對反應速率的影響

　　缺電子烯和富電子烯與巰基的反應是巰基-烯點擊化學反應的主要兩種類型。巰基與富電子烯之間反應迅速，如降冰片烯與巰基的反應速率很快。巰基與缺電子烯之間反應較慢，如馬來酰亞胺、丙烯酸酯等。這是由于缺電子烯的雙鍵需要被激活，所以需要弱堿性的催化劑催化才能進行，如三乙胺等親核試劑。一般而言，巰基-烯點擊反應的反應速率隨著烯類單體碳碳雙鍵電荷密度的下降而下降。

　　3巰基-烯反應介導的生物標記技術

　　目前，巰基-烯點擊反應已經應用于反應物官能化和聚合反應中，并且在生物分子的官能化方面已經有良好的應用。巰基-烯點擊反應滿足生物材料所要求的選擇性、易于實施和高產率的特點，因此可以應用于生物材料的標記以實現生物分子功能化。雖然熱敏自由基引發劑如偶氮二異丁腈已經被應用于在生物材料的功能化領域，但是在大規模合成時，受反應器設計和光衰減等因素的限制，升高 反應溫度才能更好的實現生物材料本體自由基均勻生成[6]。而巰基-烯點擊反應在不需要升高溫度的條件下，也可以容易地實現生物材料本體自由基均勻化和官能化。

　　4巰基-烯點擊反應在生物傳感中的應用

　　隨著巰基-烯反應應用范圍的不斷拓寬以及生物傳感器在檢測中的快速發展，巰基-烯反應介導的生物傳感器逐漸增多，如熒光生物傳感器、細胞傳感器、電化學傳感器等。可以實現miRNA、DNA、含有巰基的生物活性物質、整合素αvβ3過表達細胞、哺乳動物細胞、葡萄糖氧化酶、乳糖酶和凝集素等的檢測。

　　5巰基-烯點擊反應在細胞成像中的應用

　　生物成像可以用于詳細了解細胞過程和疾病機制。巰基-烯點擊反應作為無金屬參與的點擊反應，在反應動力學、反應物毒性以及生物利用度等屬性上都十分適用于生物分子在細胞及體內的成像，有助于人們更好地了解生物分子參與的生物過程以及在生物體系中的發揮的作用。細胞成像一般需要發生肽或蛋白質特異性反應，才能實現細胞的圖案化。利用巰基-烯點擊反應可以將烯基官能化(烯丙基和降冰片烯殘基)防污聚合物刷與細胞黏附附肽RGD和精氨酸谷氨酸天冬氨酸纈氨酸偶聯后，可以觀察聚合物刷對臍靜脈內皮細胞的黏附作用。

　　另外，為了實現良好的細胞成像功能，可以在聚合物刷子的表面連接上光致發光肽，通過熒光顯微鏡和原子力顯微鏡能夠觀察到細胞微陣列[36]。含有烯基的四苯乙烯-馬來酰亞胺加合物是一種巰基特異性生物探針。當這種生物探針暴露于含有巰基的L-半胱氨酸時，通過巰基-烯點擊化學反應，可以產生易于觀察的熒光。

　　因此可以利用四苯乙烯-馬來酰亞胺加合物作為可視化試劑對活細胞進行標記，得到清晰的熒光圖像。這為描繪細胞中含有巰基的化合物的分布提供了一個簡便、特異、靈敏的熒光標記方法[28]。利用硫醇-烯點擊化學反應可以將含有巰基的聚乙二醇有效地引入非熒光納米金剛石中，得到聚乙二醇化的熒光納米金剛石。這種復合材料顯示出高的水分散性、強的熒光性和低的細胞毒性，并具有良好的細胞染色性能，在生物成像方面顯示出巨大潛力[37]。

　　6巰基-烯點擊反應在納米材料的生物功能化中的應用

　　隨著新型材料的特性不斷被發掘，納米材料作為其中一員，因其結構龐大，負載能力高以及獨特且可調控的物理和化學性質成為藥物遞送系統開發中的重要工具。巰基-烯點擊反應介導的納米材料藥物遞送技術也得到一定程度的發展。巰基烯點擊化學反應可以將具有巰基的各種化合物綴合到烯基官能化的硅納米顆粒的表面，而不影響硅納米顆粒的特征熒光性質[38]。硫醇-烯烴點擊化學反應可以在大氣環境下功能化硅表面而不引入氧化硅，否則會對電子性能產生不利影響。有的研究學者在非常溫和的條件下利用巰基-烯點擊化學的方法將各種功能分子連接到無氧化物的Si(111)表面上，而不引入氧化硅。這種方法具有通用、有效、簡便的和可模式化等特點，為生物功能電子學提供了新的途徑[39]。

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　　7展望

　　巰基-烯點擊化學反應因其簡便性受到了科研工作者的青睞。巰基-烯點擊反應的操作性強，產率和轉化率高，反應速度快等優勢，使其在聚合物科學和分子合成方面具有很大的潛力。目前巰基-烯點擊反應在生物傳感領域的應用仍有一些不足之處：(1)目前合成含有雙鍵的單體或聚合物的方法已經比較成熟，且得到的化合物種類豐富。而含有巰基的化合物的合成過程復雜，并且巰基化合物結構種類不足。這不利于了巰基-烯點擊化學反應在生物傳感領域擴大應用范圍。因此，探索合成不同種類和官能度的巰基化合物是之后的研究重點之一。(2)對生物分子不同位置進行官能團標記的成本較高也限制了巰基-烯點擊反應在生物傳感領域的廣泛應用。(3)目前巰基-烯點擊化學反應主要集中于檢測小分子和核酸的熒光傳感器，導致傳感器的種類缺乏多樣性。因此，將巰基-烯點擊化學反應更多的應用于其他類型生物傳感器是值得研究的方向，如光譜生物傳感器、可視顯色傳感器、仿生傳感器等。這將有助于拓寬巰基-烯點擊反應的應用范圍。

　　參考文獻：

　　[1]KolbHC,FinnMG,SharplessKB.Clickchemistry：diversechemicalfunctionfromafewgoodreactions[J].AngewChemIntEdEngl,2001,40(11)：2004-2021.

　　[2]NweK,BrechbielMW.Growingapplicationsof“clickchemistry”forbioconjugationincontemporarybiomedicalresearch[J].CancerBiotherRadiopharm,2009,24(3)：289-302.

　　[3]LoweAB.Thiol-ene“click”reactionsandrecentapplicationsinpolymerandmaterialssynthesis[J].PolymChem,2010,1(1)：17-36.

　　作者：鄭淑娟1 仝濤1，2 許文濤1，2，3 黃昆侖1，2，3

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