本文摘要：摘要：從鰻鱺腸道中篩選出一株具備高效降解亞硝酸鹽與硝酸鹽和安全的優(yōu)良芽孢桿菌B1，經(jīng)過16SrRNA序列分析與生理生化檢測(cè)，鑒定為地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)。該菌株在葡萄糖10g/L，28℃好氧條件下培養(yǎng)24h，亞硝酸鹽由85.61mg/L降低至0.47mg/L，
摘要：從鰻鱺腸道中篩選出一株具備高效降解亞硝酸鹽與硝酸鹽和安全的優(yōu)良芽孢桿菌B1，經(jīng)過16SrRNA序列分析與生理生化檢測(cè)，鑒定為地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)。該菌株在葡萄糖10g/L，28℃好氧條件下培養(yǎng)24h，亞硝酸鹽由85.61mg/L降低至0.47mg/L，降解率99.45%;硝酸鹽由96.12mg/L降低至1.04mg/L，降解率98.92%，氨氮由52.74mg/L降至18.71mg/L，降解率為64.52%。在模擬處理養(yǎng)殖水體，接種終濃度為106CFU/mL菌株B1后，3d后亞硝酸鹽濃度由5.15mg/L降低至0.41mg/L，降解率達(dá)92.04%，5d降解至0.09mg/L，達(dá)到養(yǎng)殖水體標(biāo)準(zhǔn);鰻鱺在含菌株B1終濃度為108CFU/mL水體，15d無明顯病理變化。試驗(yàn)結(jié)果說明：鰻鱺腸道原籍菌株B1具有高效的硝化與好氧反硝化的能力，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物安全、無副作用。研究結(jié)果表明，菌株B1有助于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的生物脫氮或含高濃度氮的廢水處理，具有良好的微生態(tài)開發(fā)應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌;亞硝酸鹽;硝酸鹽;脫氮能力;好氧反硝化
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大與養(yǎng)殖密度趨向集約化，加上傳統(tǒng)的靜水、高密度與高投餌的飼養(yǎng)模式，導(dǎo)致養(yǎng)殖水質(zhì)污染問題越來越 嚴(yán)重，尤其亞硝酸鹽污染[1]。研究表明，當(dāng)養(yǎng)殖水體中含氮物質(zhì)的生成量超過水體自然菌群的代謝降解速率，則含氮物質(zhì)不斷沉積于池底，這也是亞硝酸鹽等有害物質(zhì)不斷累積的主要原因[2，3]。亞硝酸鹽通過魚的鰓進(jìn)入體內(nèi)，導(dǎo)致體內(nèi)亞硝酸鹽含量過高[4]，血液中Fe2+被氧化成Fe3+，導(dǎo)致血液運(yùn)輸氧氣能力減弱或散失，從而誘發(fā)魚病，甚至導(dǎo)致大量的水產(chǎn)動(dòng)物死亡[5-8]。
養(yǎng)殖方向評(píng)職知識(shí)：水產(chǎn)養(yǎng)殖方面有什么學(xué)術(shù)型論文文獻(xiàn)
亞硝酸鹽由氨轉(zhuǎn)化而來，再經(jīng)過硝化細(xì)菌利用轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}[9]，硝態(tài)氮(NO3-)最后經(jīng)過反硝化細(xì)菌的反硝化作用轉(zhuǎn)化為氮?dú)?N2)進(jìn)入大氣中;但硝化細(xì)菌繁殖速度較慢，約18h一代，而亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽所需時(shí)間較長(zhǎng)[10]，導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累。傳統(tǒng)反硝化細(xì)菌的反硝化作用需要厭氧環(huán)境才能發(fā)揮作用，而在水產(chǎn)高密度養(yǎng)殖中往往需要通過增氧來保證有足夠的溶解氧，這導(dǎo)致厭氧反硝化細(xì)菌的反硝化作用就無法正常發(fā)揮作用。
好氧反硝化可以無需厭氧就能有效地降低養(yǎng)殖水中硝酸鹽含量，既不受約于養(yǎng)殖水體中的溶氧同時(shí)又能降低硝酸鹽含量，因此，尋求一種既能快速降解亞硝酸鹽，又能在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用的菌株，顯得十分重要，受到越來越多的學(xué)者關(guān)注和研究。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者的不斷研究，已經(jīng)分離多株具備好氧反硝化的菌株，并對(duì)它的脫氮能力進(jìn)行研究[11-15]，如一類好氧或兼性好氧的芽孢桿菌屬(Bacillus)[16]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[17]等可以在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用。
其中芽孢桿菌具有繁殖速度快、可形成芽孢、生命力強(qiáng)、生長(zhǎng)代謝過程可產(chǎn)生多種酶類、可降解水體中有機(jī)質(zhì)，可更好地達(dá)到凈化水質(zhì)效果[18]，楊艷等[19]采用巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)改善養(yǎng)殖水體，亞硝酸鹽含量顯著降低;熊焰等[20]與高海英等[21]分別從養(yǎng)殖水體中采用亞硝酸鹽富集方法分離出一株巨大芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌，2株菌株對(duì)亞硝酸鹽具有良好降解能力。
為了篩選能高效降解亞硝酸鹽、具有硝化與好氧反硝化功能，在水體能快速繁殖、凈化水質(zhì)的具安全性原籍芽孢桿菌，本研究取材于健康鰻鱺腸道，針對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行菌株分離，通過亞硝酸鹽富集培養(yǎng)、復(fù)篩，以及對(duì)氨氮、硝酸鹽降解能力的測(cè)定，來評(píng)價(jià)篩選所得菌株的硝化與反硝化能力。旨在為其將來應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的生物脫氮，尋求高效、經(jīng)濟(jì)的微生態(tài)制劑水質(zhì)改良方法提供理論支持與新產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1鰻鱺
體重約150g的健康鰻鱺購(gòu)自福建鰻鱺某養(yǎng)殖場(chǎng)。
1.1.2培養(yǎng)基配方
(1)亞硝酸鹽富集培養(yǎng)基[22]：葡萄糖10.0g、KNO22.0g、NaCl1.0g、MgSO4·7H2O1.0g、K2HPO41.0g、水1L，pH7.2~7.4，1×105Pa滅菌15min。(2)不同氮源降解能力測(cè)定培養(yǎng)基[23]：葡萄糖10.0g、KNO20.15g(KNO30.15g或(NH4)2SO40.25g)、NaCl1.0g、MgSO4·7H2O1.0g、K2HPO41.0g、水1L，pH7.2~7.4，1×105Pa滅菌15min。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1菌株富集培養(yǎng)及純化
參考黃薇[24]與熊焰[20]等研究方法并改進(jìn)。取健康的鰻鱺解剖，無菌取其腸道，縱向剪開腸道，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)沖洗腸道內(nèi)部數(shù)次，去除腸道中糞便污水等內(nèi)容物;用無菌剪刀將清洗的腸道剪碎，加入少量無菌生理鹽水震蕩混勻，得到菌液原液。將菌液原液按10%比例接入亞硝酸鹽富集培養(yǎng)基中，裝液量100mL/250mL三角瓶，于28℃，120r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，每天加入5%(m/V)的亞硝酸鉀溶液2mL，富集培養(yǎng)7d后，80℃水浴10min，10倍梯度稀釋，取不同濃度稀釋液，涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)，分離、純化菌株，將純化好的菌株保存于-80℃超低溫冰箱中備用。
1.2.2菌株復(fù)篩與亞硝酸鹽降解能力測(cè)定試驗(yàn)
參考熊焰[20]與高海英[21]等研究方法并改進(jìn)。將各自純化好的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃、120r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)24h，4℃4000r/min離心10min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用生理鹽水清洗3次，收集菌泥，并用無菌生理鹽水稀釋終濃度為108CFU/mL的菌懸液，備用。按1%(V/V)接種量，將菌懸液接入亞硝酸鹽降解能力測(cè)定培養(yǎng)基，28℃，120r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，每隔8h取樣檢測(cè)亞硝酸鹽含量與OD600nm處吸光度。
采用N-(1-萘基)-胺光法[25]測(cè)定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量，空白對(duì)照組接入1%(V/V)無菌生理鹽水，選擇對(duì)亞硝酸鹽降解率高且效果穩(wěn)定的菌株作為備選菌。其中亞硝酸鹽降解率的計(jì)算公式為：亞硝酸鹽降解率=(對(duì)照組亞硝酸鹽濃度-試驗(yàn)組亞硝酸鹽濃度)÷對(duì)照組亞硝酸鹽濃度。
1.2.3菌株鑒定
菌株16SrRNA測(cè)序，采用16SrRNA細(xì)菌通用引物[26]進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。所得序列經(jīng)過NCBI(美國(guó)生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST進(jìn)行在線同源性比對(duì)。
2結(jié)果與分析
2.1菌株富集培養(yǎng)及純化
經(jīng)亞硝酸鹽富集培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，稀釋涂布分離得到4種菌落形態(tài)不一的菌落，通過革蘭氏染色與芽孢染色，初步確定為4種芽孢桿菌，分別編號(hào)B1、B2、B3與B4。
2.2菌株復(fù)篩與亞硝酸鹽降解能力
通過對(duì)分離得到的4株芽孢桿菌，按1%接種到亞硝酸鹽降解能力測(cè)定培養(yǎng)基中，培養(yǎng)32h后，各菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解能力結(jié)果。以0h亞硝酸鹽濃度85.61mg/L作為起始濃度，對(duì)4株分離得到的芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)篩，評(píng)定對(duì)亞硝酸鹽的降解能力強(qiáng)弱。空白對(duì)照組在32h內(nèi)，其亞硝酸鹽含量變化不大，可以當(dāng)做在這期間無降解。
而4株芽孢桿菌在前8h對(duì)亞硝酸鹽的降解差異不明顯，至16h菌株B1降解水平明顯較其他3株菌強(qiáng)(P<0.05)，24h時(shí)，菌株B1亞硝酸鹽濃度降至0.47mg/L，降解率99.45%，較其他3株菌差異顯著(P<0.05);32h時(shí)菌株B1、B2、B3與B4對(duì)亞硝酸鹽的降解率分別為99.87%、84.79%、98.86%與95.48%，菌株B1對(duì)亞硝酸鹽的降解率與菌株B2差異顯著(P<0.05b3b4p>0.05)。此外，4株芽孢桿菌在前16hOD600值都呈快速增長(zhǎng)，在32h內(nèi)，菌株B1與菌株B3，菌株B2與菌株B4的OD600值變化趨勢(shì)相似。4株菌株的OD600值變化與對(duì)亞硝酸鹽降解呈正相關(guān)，說明菌株的繁殖，伴隨著亞硝酸鹽的降解。由此，選取菌株B1作為研究目的菌株。
3討論
3.1菌株富集培養(yǎng)與復(fù)篩
由鰻鱺腸道經(jīng)過亞硝酸鹽富集培養(yǎng)7d，于80℃水浴10min，殺死不能形成芽孢的菌體，分離得到的菌株主要為芽孢桿菌，保證了菌株的原籍性，篩選出來的菌株有利于鰻鱺腸道定植，且對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物安全性高、適應(yīng)能力強(qiáng)。本研究分離篩選得到4株芽孢桿菌，通過以10g/L葡萄糖為碳源、亞硝酸鉀為唯一氮源的培養(yǎng)基復(fù)篩，菌株B1在培養(yǎng)至24h時(shí)亞硝酸鹽濃度由85.61mg/L降低至0.47mg/L，降解率達(dá)99.45%，與另外3株菌株的降解效果差異顯著(P<0.05);菌株B1降解亞硝酸鹽效果明顯優(yōu)于枯草芽孢桿菌T905[21，31]、腸膜明串珠菌[32]硝化細(xì)菌[33]、光合細(xì)菌Ⅰ[34]。隨著畜牧業(yè)“減抗/替抗”，菌株B1為鰻鱺腸道原籍菌，作為益生菌研發(fā)，實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖，具有較大的潛力。
3.2氨氮與硝酸鹽降解能力
芽孢桿菌能有效降解養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽[35，36]，且具備反硝化作用能力[37]，從而達(dá)到去除水體中的氮。本研究以10g/L葡萄糖作為碳源，硫酸銨或硝酸鉀作為唯一氮源，培養(yǎng)菌株B1，在24h時(shí)，氨氮濃度由52.74mg/L降低至18.71mg/L，降解率為64.52%，與郭強(qiáng)等[38]報(bào)道的地衣芽孢桿菌相似，而在32h時(shí)對(duì)氨氮的降解率達(dá)89.65%;在24h時(shí)，硝酸鹽濃度由96.12mg/L降低至1.04mg/L，降解率98.92%，與劉晶 晶等[39]報(bào)道的惡臭假單胞菌相似，但明顯優(yōu)于地衣芽孢桿菌[38]、反硝化菌[40]、紅球菌[41]等。同時(shí)，進(jìn)一步說明在相同培養(yǎng)條件下菌株B1在好氧條件下反硝化作用高于亞硝化作用。
3.3模擬處理養(yǎng)殖水體當(dāng)養(yǎng)殖水體中的亞硝態(tài)氮
(以氮計(jì))高于0.1mg/L時(shí)就會(huì)引起養(yǎng)殖動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量高于0.5mg/L時(shí)，魚會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡[42]，但是在有些嚴(yán)重污染的養(yǎng)殖水體中，亞硝酸鹽含量高達(dá)50mg/L以上[43-45]。
本研究試驗(yàn)期間，先行了解鯽魚對(duì)亞硝酸鹽的耐受，在5mg/L亞硝酸鹽濃度的水體，鯽魚外觀健康、可以存活。魚體亞硝酸鹽中毒往往呈現(xiàn)急性或亞急性過程，試驗(yàn)濃度遠(yuǎn)高于0.5mg/L，是否達(dá)到鯽魚中毒劑量，以及魚體中毒后器官受損等有待進(jìn)一步探討。本文動(dòng)態(tài)模擬處理養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽，以5.15mg/L為起始濃度，當(dāng)處理3d時(shí)亞硝酸鹽濃度降低至0.41mg/L，降解率達(dá)92.04%，低于養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽魚體中毒含量。
4d時(shí)亞硝酸鹽濃度降低至0.12mg/L，降解率達(dá)97.67%，基本為養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽魚體應(yīng)激含量，優(yōu)于同等條件下巨大芽孢桿菌處理4d后亞硝酸鹽降低至0.235mg/L;5d亞硝酸鹽濃度降低至0.09mg/L，達(dá)到養(yǎng)殖水體標(biāo)準(zhǔn)。然而，在復(fù)篩試驗(yàn)中，菌株B1在24h對(duì)亞硝酸鹽的降解率為99.45%，這可能是復(fù)篩培養(yǎng)基含有葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更有利于菌株的繁殖，提高了對(duì)亞硝酸鹽的降解效果。結(jié)果表明，在益生菌處理養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充葡萄糖等碳源可以提高降解效率。
4結(jié)論
本研究從鰻鱺腸道中篩選得到4株芽孢桿菌，經(jīng)16SrRNA測(cè)序與生理生化試驗(yàn)鑒定菌株B1為地衣芽孢桿菌。菌株B1能以氨氮、亞硝酸鹽或硝酸鹽作為唯一氮源，在24h對(duì)亞硝酸鹽的降解率達(dá)99.45%，氨氮降解率達(dá)64.52%與硝酸鹽降解率達(dá)98.92%。模擬處理養(yǎng)殖水體試驗(yàn)，4d菌株B1對(duì)亞硝酸鹽的降解由5.15mg/L降低至0.12mg/L，降解率達(dá)97.67%，且對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物安全、無致病和毒副作用。
綜上所述，本研究篩選的菌株B1在好氧培養(yǎng)的條件下具有高效的硝化與反硝化作用能力，與傳統(tǒng)好氧硝化細(xì)菌與厭氧反硝化細(xì)菌相比具有繁殖速度快、能在有氧條件下完成硝化與反硝化作用的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究對(duì)養(yǎng)殖水體生物脫氮理論研究具有一定參考意義，也為研發(fā)水質(zhì)改良微生物制劑奠定基礎(chǔ)。
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作者：林松泉1，李忠琴2，喬欣君1，林章秀1，鄒文政2
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