本文摘要：摘要：從鰻鱺腸道中篩選出一株具備高效降解亞硝酸鹽與硝酸鹽和安全的優良芽孢桿菌B1，經過16SrRNA序列分析與生理生化檢測，鑒定為地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)。該菌株在葡萄糖10g/L，28℃好氧條件下培養24h，亞硝酸鹽由85.61mg/L降低至0.47mg/L，
摘要：從鰻鱺腸道中篩選出一株具備高效降解亞硝酸鹽與硝酸鹽和安全的優良芽孢桿菌B1，經過16SrRNA序列分析與生理生化檢測，鑒定為地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)。該菌株在葡萄糖10g/L，28℃好氧條件下培養24h，亞硝酸鹽由85.61mg/L降低至0.47mg/L，降解率99.45%;硝酸鹽由96.12mg/L降低至1.04mg/L，降解率98.92%，氨氮由52.74mg/L降至18.71mg/L，降解率為64.52%。在模擬處理養殖水體，接種終濃度為106CFU/mL菌株B1后，3d后亞硝酸鹽濃度由5.15mg/L降低至0.41mg/L，降解率達92.04%，5d降解至0.09mg/L，達到養殖水體標準;鰻鱺在含菌株B1終濃度為108CFU/mL水體，15d無明顯病理變化。試驗結果說明：鰻鱺腸道原籍菌株B1具有高效的硝化與好氧反硝化的能力，對水產養殖動物安全、無副作用。研究結果表明，菌株B1有助于水產養殖水體的生物脫氮或含高濃度氮的廢水處理，具有良好的微生態開發應用前景。
關鍵詞：地衣芽孢桿菌;亞硝酸鹽;硝酸鹽;脫氮能力;好氧反硝化
隨著水產養殖行業的快速發展，養殖規模不斷擴大與養殖密度趨向集約化，加上傳統的靜水、高密度與高投餌的飼養模式，導致養殖水質污染問題越來越 嚴重，尤其亞硝酸鹽污染[1]。研究表明，當養殖水體中含氮物質的生成量超過水體自然菌群的代謝降解速率，則含氮物質不斷沉積于池底，這也是亞硝酸鹽等有害物質不斷累積的主要原因[2，3]。亞硝酸鹽通過魚的鰓進入體內，導致體內亞硝酸鹽含量過高[4]，血液中Fe2+被氧化成Fe3+，導致血液運輸氧氣能力減弱或散失，從而誘發魚病，甚至導致大量的水產動物死亡[5-8]。
養殖方向評職知識：水產養殖方面有什么學術型論文文獻
亞硝酸鹽由氨轉化而來，再經過硝化細菌利用轉變為硝酸鹽[9]，硝態氮(NO3-)最后經過反硝化細菌的反硝化作用轉化為氮氣(N2)進入大氣中;但硝化細菌繁殖速度較慢，約18h一代，而亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽所需時間較長[10]，導致亞硝酸鹽的積累。傳統反硝化細菌的反硝化作用需要厭氧環境才能發揮作用，而在水產高密度養殖中往往需要通過增氧來保證有足夠的溶解氧，這導致厭氧反硝化細菌的反硝化作用就無法正常發揮作用。
好氧反硝化可以無需厭氧就能有效地降低養殖水中硝酸鹽含量，既不受約于養殖水體中的溶氧同時又能降低硝酸鹽含量，因此，尋求一種既能快速降解亞硝酸鹽，又能在有氧條件下進行反硝化作用的菌株，顯得十分重要，受到越來越多的學者關注和研究。隨著國內外學者的不斷研究，已經分離多株具備好氧反硝化的菌株，并對它的脫氮能力進行研究[11-15]，如一類好氧或兼性好氧的芽孢桿菌屬(Bacillus)[16]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[17]等可以在有氧條件下進行反硝化作用。
其中芽孢桿菌具有繁殖速度快、可形成芽孢、生命力強、生長代謝過程可產生多種酶類、可降解水體中有機質，可更好地達到凈化水質效果[18]，楊艷等[19]采用巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)改善養殖水體，亞硝酸鹽含量顯著降低;熊焰等[20]與高海英等[21]分別從養殖水體中采用亞硝酸鹽富集方法分離出一株巨大芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌，2株菌株對亞硝酸鹽具有良好降解能力。
為了篩選能高效降解亞硝酸鹽、具有硝化與好氧反硝化功能，在水體能快速繁殖、凈化水質的具安全性原籍芽孢桿菌，本研究取材于健康鰻鱺腸道，針對芽孢桿菌進行菌株分離，通過亞硝酸鹽富集培養、復篩，以及對氨氮、硝酸鹽降解能力的測定，來評價篩選所得菌株的硝化與反硝化能力。旨在為其將來應用于水產養殖的生物脫氮，尋求高效、經濟的微生態制劑水質改良方法提供理論支持與新產品開發提供依據。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1鰻鱺
體重約150g的健康鰻鱺購自福建鰻鱺某養殖場。
1.1.2培養基配方
(1)亞硝酸鹽富集培養基[22]：葡萄糖10.0g、KNO22.0g、NaCl1.0g、MgSO4·7H2O1.0g、K2HPO41.0g、水1L，pH7.2~7.4，1×105Pa滅菌15min。(2)不同氮源降解能力測定培養基[23]：葡萄糖10.0g、KNO20.15g(KNO30.15g或(NH4)2SO40.25g)、NaCl1.0g、MgSO4·7H2O1.0g、K2HPO41.0g、水1L，pH7.2~7.4，1×105Pa滅菌15min。
1.2試驗方法
1.2.1菌株富集培養及純化
參考黃薇[24]與熊焰[20]等研究方法并改進。取健康的鰻鱺解剖，無菌取其腸道，縱向剪開腸道，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)沖洗腸道內部數次，去除腸道中糞便污水等內容物;用無菌剪刀將清洗的腸道剪碎，加入少量無菌生理鹽水震蕩混勻，得到菌液原液。將菌液原液按10%比例接入亞硝酸鹽富集培養基中，裝液量100mL/250mL三角瓶，于28℃，120r/min恒溫搖床震蕩培養，每天加入5%(m/V)的亞硝酸鉀溶液2mL，富集培養7d后，80℃水浴10min，10倍梯度稀釋，取不同濃度稀釋液，涂布于營養瓊脂平板，28℃培養，分離、純化菌株，將純化好的菌株保存于-80℃超低溫冰箱中備用。
1.2.2菌株復篩與亞硝酸鹽降解能力測定試驗
參考熊焰[20]與高海英[21]等研究方法并改進。將各自純化好的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28℃、120r/min恒溫搖床震蕩培養24h，4℃4000r/min離心10min，棄上清液，細菌沉淀用生理鹽水清洗3次，收集菌泥，并用無菌生理鹽水稀釋終濃度為108CFU/mL的菌懸液，備用。按1%(V/V)接種量，將菌懸液接入亞硝酸鹽降解能力測定培養基，28℃，120r/min恒溫搖床震蕩培養，每隔8h取樣檢測亞硝酸鹽含量與OD600nm處吸光度。
采用N-(1-萘基)-胺光法[25]測定培養液中亞硝酸鹽含量，空白對照組接入1%(V/V)無菌生理鹽水，選擇對亞硝酸鹽降解率高且效果穩定的菌株作為備選菌。其中亞硝酸鹽降解率的計算公式為：亞硝酸鹽降解率=(對照組亞硝酸鹽濃度-試驗組亞硝酸鹽濃度)÷對照組亞硝酸鹽濃度。
1.2.3菌株鑒定
菌株16SrRNA測序，采用16SrRNA細菌通用引物[26]進行擴增，正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，由北京睿博興科生物技術有限公司完成。所得序列經過NCBI(美國生物技術信息中心)數據庫的BLAST進行在線同源性比對。
2結果與分析
2.1菌株富集培養及純化
經亞硝酸鹽富集培養基培養1周后，稀釋涂布分離得到4種菌落形態不一的菌落，通過革蘭氏染色與芽孢染色，初步確定為4種芽孢桿菌，分別編號B1、B2、B3與B4。
2.2菌株復篩與亞硝酸鹽降解能力
通過對分離得到的4株芽孢桿菌，按1%接種到亞硝酸鹽降解能力測定培養基中，培養32h后，各菌株對亞硝酸鹽的降解能力結果。以0h亞硝酸鹽濃度85.61mg/L作為起始濃度，對4株分離得到的芽孢桿菌進行復篩，評定對亞硝酸鹽的降解能力強弱。空白對照組在32h內，其亞硝酸鹽含量變化不大，可以當做在這期間無降解。
而4株芽孢桿菌在前8h對亞硝酸鹽的降解差異不明顯，至16h菌株B1降解水平明顯較其他3株菌強(P<0.05)，24h時，菌株B1亞硝酸鹽濃度降至0.47mg/L，降解率99.45%，較其他3株菌差異顯著(P<0.05);32h時菌株B1、B2、B3與B4對亞硝酸鹽的降解率分別為99.87%、84.79%、98.86%與95.48%，菌株B1對亞硝酸鹽的降解率與菌株B2差異顯著(P<0.05b3b4p>0.05)。此外，4株芽孢桿菌在前16hOD600值都呈快速增長，在32h內，菌株B1與菌株B3，菌株B2與菌株B4的OD600值變化趨勢相似。4株菌株的OD600值變化與對亞硝酸鹽降解呈正相關，說明菌株的繁殖，伴隨著亞硝酸鹽的降解。由此，選取菌株B1作為研究目的菌株。
3討論
3.1菌株富集培養與復篩
由鰻鱺腸道經過亞硝酸鹽富集培養7d，于80℃水浴10min，殺死不能形成芽孢的菌體，分離得到的菌株主要為芽孢桿菌，保證了菌株的原籍性，篩選出來的菌株有利于鰻鱺腸道定植，且對水產動物安全性高、適應能力強。本研究分離篩選得到4株芽孢桿菌，通過以10g/L葡萄糖為碳源、亞硝酸鉀為唯一氮源的培養基復篩，菌株B1在培養至24h時亞硝酸鹽濃度由85.61mg/L降低至0.47mg/L，降解率達99.45%，與另外3株菌株的降解效果差異顯著(P<0.05);菌株B1降解亞硝酸鹽效果明顯優于枯草芽孢桿菌T905[21，31]、腸膜明串珠菌[32]硝化細菌[33]、光合細菌Ⅰ[34]。隨著畜牧業“減抗/替抗”，菌株B1為鰻鱺腸道原籍菌，作為益生菌研發，實現健康養殖，具有較大的潛力。
3.2氨氮與硝酸鹽降解能力
芽孢桿菌能有效降解養殖水體中氨氮、亞硝酸鹽[35，36]，且具備反硝化作用能力[37]，從而達到去除水體中的氮。本研究以10g/L葡萄糖作為碳源，硫酸銨或硝酸鉀作為唯一氮源，培養菌株B1，在24h時，氨氮濃度由52.74mg/L降低至18.71mg/L，降解率為64.52%，與郭強等[38]報道的地衣芽孢桿菌相似，而在32h時對氨氮的降解率達89.65%;在24h時，硝酸鹽濃度由96.12mg/L降低至1.04mg/L，降解率98.92%，與劉晶 晶等[39]報道的惡臭假單胞菌相似，但明顯優于地衣芽孢桿菌[38]、反硝化菌[40]、紅球菌[41]等。同時，進一步說明在相同培養條件下菌株B1在好氧條件下反硝化作用高于亞硝化作用。
3.3模擬處理養殖水體當養殖水體中的亞硝態氮
(以氮計)高于0.1mg/L時就會引起養殖動物應激反應，當養殖水體中亞硝酸鹽含量高于0.5mg/L時，魚會出現中毒癥狀，嚴重可導致死亡[42]，但是在有些嚴重污染的養殖水體中，亞硝酸鹽含量高達50mg/L以上[43-45]。
本研究試驗期間，先行了解鯽魚對亞硝酸鹽的耐受，在5mg/L亞硝酸鹽濃度的水體，鯽魚外觀健康、可以存活。魚體亞硝酸鹽中毒往往呈現急性或亞急性過程，試驗濃度遠高于0.5mg/L，是否達到鯽魚中毒劑量，以及魚體中毒后器官受損等有待進一步探討。本文動態模擬處理養殖水體中的亞硝酸鹽，以5.15mg/L為起始濃度，當處理3d時亞硝酸鹽濃度降低至0.41mg/L，降解率達92.04%，低于養殖水體亞硝酸鹽魚體中毒含量。
4d時亞硝酸鹽濃度降低至0.12mg/L，降解率達97.67%，基本為養殖水體亞硝酸鹽魚體應激含量，優于同等條件下巨大芽孢桿菌處理4d后亞硝酸鹽降低至0.235mg/L;5d亞硝酸鹽濃度降低至0.09mg/L，達到養殖水體標準。然而，在復篩試驗中，菌株B1在24h對亞硝酸鹽的降解率為99.45%，這可能是復篩培養基含有葡萄糖等營養物質，更有利于菌株的繁殖，提高了對亞硝酸鹽的降解效果。結果表明，在益生菌處理養殖水體亞硝酸鹽時，適當補充葡萄糖等碳源可以提高降解效率。
4結論
本研究從鰻鱺腸道中篩選得到4株芽孢桿菌，經16SrRNA測序與生理生化試驗鑒定菌株B1為地衣芽孢桿菌。菌株B1能以氨氮、亞硝酸鹽或硝酸鹽作為唯一氮源，在24h對亞硝酸鹽的降解率達99.45%，氨氮降解率達64.52%與硝酸鹽降解率達98.92%。模擬處理養殖水體試驗，4d菌株B1對亞硝酸鹽的降解由5.15mg/L降低至0.12mg/L，降解率達97.67%，且對水產動物安全、無致病和毒副作用。
綜上所述，本研究篩選的菌株B1在好氧培養的條件下具有高效的硝化與反硝化作用能力，與傳統好氧硝化細菌與厭氧反硝化細菌相比具有繁殖速度快、能在有氧條件下完成硝化與反硝化作用的獨特優勢。本研究對養殖水體生物脫氮理論研究具有一定參考意義，也為研發水質改良微生物制劑奠定基礎。
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作者：林松泉1，李忠琴2，喬欣君1，林章秀1，鄒文政2
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