本文摘要：摘要：綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是目前研究較多的生防菌種之一。十九世紀初，Miguela首次分離，將其鑒定為假單胞菌(Pseudomonas)，并將機會性病原菌綠膿桿菌作為其模式菌株，而后Peix于007年，重新將其分類為綠針假單胞菌亞種(P.chlororaphi)。
摘要：綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是目前研究較多的生防菌種之一。十九世紀初，Miguela首次分離，將其鑒定為假單胞菌(Pseudomonas)，并將機會性病原菌綠膿桿菌作為其模式菌株，而后Peix于007年，重新將其分類為綠針假單胞菌亞種(P.chlororaphi)。目前該菌種已報道有個亞種，均可產生有顏色的吩嗪類化合物抗生素。該種的菌株多分離自植物根際，對植物抵抗病原菌、線蟲等的侵染起到保護作用。本文結合我們分離獲得的一株綠針假單胞菌的功能研究、基因組分析及相關文獻資料，系統描述了綠針假單胞菌的分類學特征、基因組特點、代謝產物功能及其應用開發前景等，以期為綠針假單胞菌在活性代謝產物發掘、基因功能研究及其農業應用等方面提供借鑒。
關鍵詞：綠針假單胞菌，生防，次生代謝產物，農業應用
土壤環境一直被視為微生物資源開發的天然寶庫，土壤中存在很多具有促進植物生長、抑制植物病原菌活性的微生物[1]。這些具有生防功能的根際促生菌，在維持植物正常生長、抵抗病原生物等方面發揮了至關重要的作用。假單胞菌(Pseudomonas)作為普通生境優勢細菌屬之一，廣泛活躍于植物周圍(包括植物根際與葉面)，其屬內很多菌株為植物根際促生菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria，PGPR)，這些菌株定植于植物根際，幫助植物抵御病害并促進植物的生長[2-3]。
農業土壤論文范例：土壤環境質量新標準評價應用誤區探討
作為生防領域最具應用潛力的菌株，假單胞菌屬主要從以下三個方面發揮其生防功能：(1)合成抗生素抑制病原生物。生防假單胞菌可分泌多種類型的抗生素，其代表為吩嗪類抗生素，如吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid，PCA)、綠膿菌素(Pyocyanin，PYO)等[3];(2)部分假單胞菌具有合成和分泌鐵載體能力，可將土壤中的Fe3+轉化成為可被細胞吸收的Fe2+的形式，以促進植物生長。另外，菌株可以通過對鐵元素競爭，從而抑制病原菌生長[2,4]。(3)存在誘導因子，誘導植物產生系統抗性(inducedsystemicresistance，ISR)。如熒光假單胞菌WCS358存在多個誘導因子，均能使擬南芥產生ISR[2,5-6]。
綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)是公認的環境友好型植物促生菌，該菌株分布范圍廣，對生態環境具有較強適應能力。大多數綠針假單胞菌是從植物根際分離獲得，菌株的代謝產物對植物具有一定的保護作用，具有生防的潛力與應用前景，因此該菌株獲得生防領域的廣泛關注[7-8]。本文擬在綠針假單胞菌分類學特征、活性代謝產物、菌株生防功能的基礎上，發掘其農業上的開發應用前景，結合目前實驗室的科學方法和技術，為進一步揭示其基因功能和調控機理提供可能與借鑒。
1綠針假單胞菌的分類地位與基本特征
十九世紀初，MIguela首次分離獲得綠針假單胞菌，并將其鑒定為假單胞菌[8]。綠針假單胞菌的分類鑒定較為復雜。起初，菌株Pseudomonaschlororaphis，Pseudomonasaureofaciens和Pseudomonasaurantiaca均被認為是假單胞菌屬中的獨立的種。
直到1989年，Johnson和Palleroni基于DNA同源性及其表型等特點，提議將P.aureofaciens作為P.chlororaphis同種異型菌株[9]。2005年，在第二版的伯杰氏系統細菌學手冊Palleroni將P.aureofaciens和P.chlororaphis合并為P.chlororaphis，但此時P.aurantiaca仍然被許多研究者作為獨立的種在使用[9-11]。2007年，Peix基于菌株的表型特征及分子生物學的相關數據，將綠針假單胞菌的相關菌株重新分類，將其命名為P.chlororaphis，并包含三個亞種，分別為P.chlororaphissubsp.aurantiaca，P.chlororaphissubsp.chlororaphis和P.chlororaphissubsp.aureofaciens[10]。010年，綠針假單胞菌增加一個新的分枝—綠針假單胞菌雙魚亞種(.chlororaphissubsp.piscium)[12-13]，該菌株分離自魚的腸道內。之前研究較多的、分離自番茄根際的菌株CL1391，也屬于該亞種[8]。
本實驗室之前在番茄根際土壤中分離獲得菌株PS41，經16SrRNA測序比對，鑒定為綠針假單胞菌致金色亞種P.chlororaphissubsp.aureofaciensPS41[14]，該菌株可產生揮發性物質抑制黑斑病病菌的生長，并對秀麗隱桿線蟲具有高效毒殺活性[14-15]。綠針假單胞菌是革蘭氏陰性菌，好氧，可運動，菌體呈綠色、黃色或橙色的γ變形菌綱[8]。典型的綠針假單胞菌株具有定植于植物的能力，并具有抑制植物病原菌的活性[1]。
Peix等人也討論了綠針假單胞菌亞種之間的一些可變表型，比如潛在的反硝化的能力，以阿拉伯糖或葡萄糖酸鹽作為碳源的潛能[10,13]。綠針假單胞菌在營養豐富的培養基上生長時，不同亞種之間存在一些可視的識別特征即色素，這些色素的產生與綠針假單胞菌產生的抗真菌類物質吩嗪(henazines)有關。菌株PS41產生的次級代謝產物主要介導了對病原生物的拮抗作用，這些次級代謝產物是受雙組分調控體系GacGacA調節[1]。
2綠針假單胞菌的活性代謝產物研究
2.1綠針假單胞菌產生的抗生素
綠針假單胞菌可以合成多種拮抗病原菌的抗生素(吩嗪衍生物，HCN，鐵載體等)，而這些代謝產物的特性決定了綠針假單胞菌的生防潛質及應用前景。綠針假單胞菌可產生特征性色素，其中P.chlororaphissubsp.chlororaphis呈現出綠色，P.chlororaphissubsp.aureofaciens產生金黃色色素，P.chlororaphissubsp.aurantiaca呈現出橙色，P.chlororaphissubsp.piscium可產生綠色與橙色兩種色素。
在產生抗生素的種類方面，不同的亞種之間也有明顯的區別，P.chlororaphissubsp.aurantiaca和P.chlororaphissubspaureofaciens產生的抗生素種類類似，主要有吩嗪羧酸，羥基吩嗪羧酸(hydroxyphenazinecarboxylicacid，OHPCA)，硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，Prn)，hexyl,5propylresorcinol[16];P.chlororaphissubspchlororaphis產生的抗生素主要有吩嗪甲酰胺(Phenazine1carboxamide，PCN)，吩嗪羧酸，羥基吩嗪羧酸，硝吡咯菌素，hexyl,5propylresorcinol[17];P.chlororaphissubsppiscium產生的抗生素種類相對較少，主要為吩嗪甲酰胺和吩嗪羧酸。
2.2吩嗪類化合物的特點和功能
自然界中，天然的吩嗪化合物為色彩豐富的含氮次生代謝產物，合成于細胞生長的穩定期，這類化合物對植物細胞的生長發育無顯著影響，但本身具有廣譜抗菌性，可用于防治植物真菌性病害[18-19]。有研究表明，產吩嗪類化合物的微生物對環境具有更好的適應性。綠針假單胞菌在富營養的培養基上生長時，可產生色素，這也是分離鑒定該菌種的一個標志性特征，而這種色素的產生主要歸因于該種菌株產生三環含氮物質—吩嗪，吩嗪具有抗菌的功能，能影響細胞的信號[20]。
假單胞菌是最早被發現的吩嗪類物質產生菌，在很長一段時間內，假單胞菌被認為是唯一產生天然吩嗪類化合物的菌屬，其中熒光假單胞菌通常只合成一種吩嗪類化合物(吩嗪羧酸)，而其他的假單胞菌則可以產生兩種或以上的吩嗪類物質[3,21-22]。綠針假單胞菌株CL1319、P72和T66等，均可高效合成吩嗪類化合物。吩嗪類化合物在菌株與植物互作過程中發揮了重要的作用[20]。例如菌株CL1319產生的吩嗪對尖孢鐮刀菌具有較高的抗真菌活性[23]。吩嗪類化合物作為高效的抗菌劑，對環境友好，具有良好的農業應用與開發前景。
假單胞菌合成的吩嗪化合物主要具有種功能：抑制植物病原微生物和線蟲的侵染，保護植物[3];菌株在產生吩嗪類化合物和形成生物膜過程中，可促使植物的根際分泌可被菌體利用的營養物質，二者互利共生[3];、可誘導番茄和大豆等植物的系統抗性。此外，吩嗪類化合物還能夠改變環境的理化性質[3,24]。
2.3硝吡咯菌素和間苯二酚的抗菌作用
除吩嗪之外，綠針假單胞菌還可以產生其他代謝產物幫助植物抵抗微生物病原菌，如：硝吡咯菌素和間苯二酚[7]，這些物質在植物本身的抗病體系中發揮了重要的作用。硝吡咯菌素是含有吡咯環的化合物，對多種真菌具有抑制作用，這一類抗生素在人類醫藥和農用殺菌劑領域都有商業化應用[25]。菌株CL1606雖然也能產生吩嗪，但是其產生的hexylpropylresorcinol是防治鱷梨白腐病的關鍵物質。而綠針假單胞菌PA23產生吡咯硝酸鹽是其控制油菜白腐病的主要抗菌物質，而非吩嗪。菌株05產生的吡咯硝酸鹽是抑制赤霉病菌的主要代謝產物[26]。因此，硝吡咯菌素和間苯二酚在綠針假單胞菌協助植物抵抗病原菌的過程中也發揮了重要的作用。
2.4氰化氫的殺蟲功能
綠針假單胞菌能夠產生氰化氫(CN)—由甘氨酸組成的一種簡單的水溶性揮發物質。綠針假單胞菌A23的殺線蟲活性與其產生的硝吡咯菌素和氰化氫均有著密切的關系[27]。另外，Flury等人對綠針假單胞菌CL1391的研究顯示，氰化氫是該菌株毒殺線蟲幼蟲的關鍵組分，而非吩嗪或吡咯菌素[28]，綠針假單胞菌株產生的氰化氫可導致線蟲[29]和蚜蟲細胞死亡[30]。
2.5揮發性有機物(Volatileorganiccompounds,VOCs)的生防功能
目前，微生物產生的揮發性有機物的功能研究吸引了很多學者的關注，研究表明揮發性有機物可以通過長距離擴散從而保護植物。由于微生物代謝的多功能性，一些自然界中原本不存在的揮發性物質，很可能會在微生物生長的過程中被釋放出來，從而具有一些特殊的功能。
已有報道綠針假單胞菌可產生揮發性物質幫助植物抵抗病原菌，例如，致金色綠針假單胞菌PS41可以產生揮發性物質甲基丁醇、甲基丁醇和苯乙醇，對甘薯黑斑病菌有抑制作用，該菌株產生的揮發性物質辛酸乙酯對秀麗隱桿線蟲C.elegans具有高效毒殺作用[14-15]。綠針假單胞菌和KNU17P可以產生碳氫化合物和十一烷;在菌株和71的代謝產物中，也檢測到了含硫的化合物組分，例如硫化氫、二甲基硫醚和甲硫醇等[31]。這些代物一方面可能直接抑制植物病原菌，另一方面可能與誘導植物防御反應有關。在微生物定殖于植物或其他寄主的條件下，產生的多種揮發性有機物，可以建立一種信號或一種雞尾酒式的OC混合物的作用模式，對于進一步研究綠針假單胞菌的生防機制具有深層次的意義。
3綠針假單胞菌基因組與功能基因簇研究
綠針假單胞菌作為根際共生細菌，其能影響植物生長，并在控制植物病害和提高作物產量等方面具有廣闊的應用前景，因而對于該菌株的研究也逐步深入。綠針假單胞菌的主要研究方向包括菌株產活性物質的分離篩選、代謝途徑的研究、菌株生物膜的形成、群體感應體系、雙組分調節系統，而這一系列的研究都與菌株的基因組學關系緊密，基因組學的研究也成為構建該菌株基因資源庫的理論支撐。近年來，綠針假單胞菌基因組數據不斷完善，為該菌株的基因組改造的實施奠定了基礎[16]。
4綠針假單胞菌的應用研究現狀
綠針假單胞菌可以合成多種抗生素，具有抵抗病原生物的作用，綠針假單胞菌還具有較強的植物根際促生能力，使其在農業和園藝領域得以廣泛應用[47]。綠針假單胞菌對多種植物有防病促生作用[48]，能增強植物的抗逆性[49-50]、對環境友好、對生物無致病性[51]。
例如，防治番茄枯萎病[52]、煙草疫霉病[53]、辣椒疫霉病[54]、柏樹潰瘍病[48]和豆類炭疽病[55]等，同時對幾種農業重要病原細菌有明顯的抑制作用，如莢殼伯克霍爾德菌(Burkholderiaglumae)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、密執安棒桿菌(Clavibactermichiganesis)、胡蘿卜果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovora)、丁香假單胞菌(Pseudomonas.yringae)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)等[56]。
綠針假單胞菌中的很多菌株已被廣泛且深入研究。菌株3084可合成吩嗪羧酸、羥基吩嗪羧酸和羥基吩嗪等抗生素，可以有效抑制小麥全蝕病[57]。而菌株PCL1391合成吩嗪羧酸和吩嗪甲酰胺，可有效抑制番茄病原菌尖孢鐮刀菌和可可棕櫚病原菌群結腐霉[58]。
菌株O6能合成藤黃綠菌素、吩嗪羧酸、羥基吩嗪羧酸和羥基吩嗪等物質抑制病原菌，同時可以誘導系統抗性，維持煙草葉和黃瓜葉的健康生長[59]。菌株P72可以合成吩嗪羧酸、羥基吩嗪羧酸和羥基吩嗪三種吩嗪化合物。菌株A23產生的硝吡咯菌素和氰化氫具有殺線蟲活性[27]。
菌株SPS41產生的揮發性有機物辛酸乙酯和乙酸乙酯等具有高效的殺線蟲活性[14]。綠針假單胞菌產生的代謝產物具有多樣性，而其作為根際細菌具有防治病原菌、殺蟲等功效，其產生的揮發性物質在果蔬采后的保存過程中，也具有重要作用[15]，菌株PS41產生的揮發性氣體甲基丁醇、甲基丁醇和苯乙醇對甘薯黑斑病病菌有顯著的拮抗作用，克服了化學農藥在防治甘薯采后黑斑病中存在的污染環境、毒素殘留、威脅人類健康、催生抗藥菌等問題，在果蔬的采后保存中具有潛在的應用價值[15,60]。
5結語和展望
綠針假單胞菌作為生防細菌資源應用在農業及食品業具有顯著的優勢。一方面，綠針假單胞菌來源方便，廣泛分布于普通土壤環境及植物根際;另一方面，這類菌株是環境友好型微生物，菌株無毒性無污染，不會對人體造成傷害，也不會污染環境，應用于農業及食品業具有安全性。美國環保局認證了綠針假單胞菌為非人體、野生動物及環境病原菌，部分相關的商業產品已經應用[1]。除此之外，綠針假單胞菌可分泌抗生素和鐵載體，并且在特定的環境下可以誘導系統抗性以及促進植物生長，這些優勢都為綠針假單胞菌的廣泛應用奠定了基礎。
目前，國際上研究報道較多的是利用綠針假單胞菌防治真菌和卵菌病害。綠針假單胞菌在生防制劑的商業應用主要包括代謝產物的應用和菌株細胞的應用。在代謝產物應用方面，綠針假單胞菌基因組學、轉錄組及代謝組學的研究成果，為該菌的基因修飾從而高效產生特定代謝產物提供了理論依據。綠針假單胞菌的基因組學分析顯示，四個亞種共挖掘到類、43個基因簇，而個亞種共同的基因簇只有個，說明綠針假單胞菌中還有大量未開發的次級代謝產物。
綠針假單胞菌可產生多種高效抗生素抑制病原生物，產生吲哚乙酸促進植物生長，產生應用于食品工業的羥基苯甲酸及其衍生物，這些都是可以進一步發掘的資源。針對不同的需求，可通過對菌株的代謝途徑進行合理設計和遺傳學修飾，改造細胞特性從而應用于實際生產中。
該菌在代謝產物方面的應用潛力，可以從以下幾個方向深入發掘：(1)通過分離代謝產物，發掘其產生的功能型抗生素;(2)高通量篩選抗生素高產菌株，為菌株的生防和工業應用提供資源;(3)以最小基因組方法，設計工程菌株，從而在節省資源的基礎上并高效獲得代謝產物;(4)克隆表達抗生素合成的基因簇，構建工業生產菌株，高效表達抗生素。
菌株細胞主要可應用于農業，作為生防制劑使用，以達到對植物的抗病促生作用，同時克服了化學農藥的弊端，從而成為真正的綠色農藥。在生物防治領域，綠針假單胞菌代謝產物具有多樣性，可高效合成吩嗪，氫化氰及揮發性有機化合物，對病原微生物、昆蟲和線蟲具有拮抗作用;菌株本身可形成生物膜，有利于其在植物根際的定殖，發揮促生防病功能。總之，綠針假單胞菌具有的促進植物生長、生物防治病蟲害，以及產生豐富活性次生代謝產物的能力，使其在農業應用上具有較好的開發前景。
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作者：張春媚，徐明潔，李雪威，邢珂，秦盛
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