混合菌群調節果蠅產卵偏嗜性

　　摘要：【目的】利用果蠅產卵偏嗜性作為評價指標，研究影響混合菌群平衡的因素及競爭機制，并揭示混合菌對果蠅后代存活率的影響。【方法】將植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和二者混合菌發酵處理酪蛋白瓊脂食物;利用雙向選擇產卵器檢測成年雌性果蠅的產卵偏嗜性;平板計數法檢測細菌數量;通過蛹存活率探究兩菌互作對果蠅存活率的影響。【結果】在37℃發酵果蠅食物，果蠅喜歡在植物乳桿菌底物上產卵，而厭惡在大腸桿菌底物上產卵，同時對等比例混合菌具有顯著的產卵避性，產卵指數為-0.46，說明果蠅產卵偏嗜性可作為一個研究混合菌群平衡的模型。增加混合菌中植物乳桿菌比例可降低果蠅產卵避性，甚至逆轉，說明接種比例影響著菌群平衡。涂板計數證實，大腸桿菌數量在培養基中占據優勢，是植物乳桿菌的4.43倍，所以引起果蠅產卵避性。當植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合后改變培養溫度，25℃對應的產卵指數為0.41，30℃對應的產卵指數為-0.06，35℃對應的產卵指數為-0.45，說明溫度影響著菌群平衡。植物乳桿菌代謝物，特別是乳酸可抑制大腸桿菌生長，從而間接地調控果蠅產卵偏嗜性。大腸桿菌占據著優勢時，蛹存活率僅為14%，而植物乳桿菌占據著優勢時，蛹存活率為91%，說明混合菌生長平衡影響果蠅存活率。【結論】接種比例與溫度是影響菌群平衡的關鍵因素，果蠅根據菌群平衡而調整其產卵行為，以提高后代的存活率。

　　關鍵詞:植物乳桿菌，大腸桿菌，接種比例，溫度，產卵偏嗜性，存活率

　　大多數自然環境都存在著大量的微生物。最近，分子生物學方法，如宏基因組測序和深度微生物標記測序，已經揭示了微生物的多樣性和復雜性。在菌群中細菌個體間不斷發生著相互交流，產生社會行為，這些信息可塑造微生物群落的結構平衡。

　　在這些社會行為中，最為顯著的關系便是競爭，細菌之間相互爭奪有限的空間和資源，可以抑制甚至殺死其他微生物[1]。通常認為，數量上占優勢的微生物種群源自一個高度多樣化、低豐度的起始種群。某些稀有成員在適宜的條件下快速增殖，可以實現種群爆發，打破原有平衡，成為優勢種群[2]。因此，揭示影響群落成員的因素對理解和調控菌群平衡具有重要研究和應用價值。

　　然而，自然群落復雜而又多變，直接研究它會困難重重，亟需某些模式菌種構建研究模型。果蠅的共生菌種類較為繁多[3]，多達20多種，廣義上既包括益生菌，如植物乳桿菌和腸球菌等，又包括有害細菌，如條件致病菌大腸桿菌和真菌等[4]。研究發現，植物乳桿菌在果蠅腸道內能發酵碳水化合物產生代謝產物，特別是乳酸，能維持果蠅腸道內低pH環境，抑制大腸桿菌的生長與繁殖[5]。同時，植物乳桿菌具有提高機體免疫力、維持腸道內菌群平衡和促進營養物質的吸收等多種作用[6]。大腸桿菌是腸桿菌科革蘭陰性菌，主要棲生于人和動物大腸內。

　　其既能在宿主體內生存,也能吸附在環境中固體介質表面，形成生物膜而得以存活和傳播[7]。大腸桿菌是果蠅體內的條件致病菌，當大腸桿菌過度繁殖時，會阻礙果蠅卵的生長和發育，甚至導致其死亡[8]。這兩種細菌常存在于果蠅體內和周圍，但目前仍然不清楚哪些因素可以影響二者之間競爭平衡。盡管高通量測序可以解析菌落物種結構和平衡，然而迄今為止尚缺乏一種簡單易行的檢測微生物競爭結果的指示方法，正成為后基因組時代的一大挑戰。由于果蠅產卵需要消耗母體大量的能量和營養，并且幼蟲運動能力弱，容易遭受天敵攻擊。

　　因此，為促進后代的生長和發育，雌性果蠅在產卵之前，必須利用多種感覺系統[9]，并且綜合多種因素，最終才會選擇在適宜的地方產卵[10-11]。果蠅產卵的選擇是果蠅一個非常重要的行為，該行為易于觀察和量化，對刺激敏感，并且抗外界干擾因素強，可為我們提供一個生物指示劑以研究菌群平衡[11]。因此，本研究嘗試將果蠅作為指示生物，通過其產卵選擇性判斷菌群平衡，并進一步探討影響混合菌群平衡的因素及競爭機制。

　　1材料和方法

　　1.1果蠅品系與培養方法

　　本研究選用野生型黑腹果蠅品系OregonR(OR)和CantonS(CS)作為實驗材料。如無特別說明，所有果蠅均培養在溫度25℃、相對濕度60%的恒溫箱中，培養光周期為12L：12D[12]。在通常情況下，果蠅使用玉米-酵母培養基飼養，由于酵母粉中成分復雜，為避免酵母對果蠅產卵行為的影響，行為學分析中使用的果蠅食物為水解酪蛋白-蔗糖-瓊脂培養基。

　　1.2試劑與儀器

　　試劑：Walch消毒液(廣州威萊);次氯酸(Sigma);酵母(安琪);MRS瓊脂培養基;麥康凱瓊脂培養基。儀器：25℃恒溫恒濕培養箱(恒豐,WS-01Y);天平(DenverInstrument,XE-310);顯微鏡(OlympusSZX7;NikonSMZ745T);低溫高轉速離心機(上海力申，Neofuge13R);分光光度計(島津，UV-1800)。

　　1.3菌落培養

　　1.3.1菌株來源：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和大腸桿菌(Escherichiacoli)均為本實驗室前期分離和鑒定的菌株，對應的NCBI編號為KY038178[13]和ATCC25922[8]。

　　1.3.2不同溫度下培養：控制兩菌接種量一致，分別從OD值為1的培養瓶中各取兩菌原菌液1mL，離心后棄上清液加入PBS磷酸鹽溶液震蕩洗滌，再離心，重復兩次;加入100mLPBS，超凈臺中將兩菌株混合，涂布固體平板酪蛋白食物表面后裝入盛有沾水紗布的密封袋中，分別放入25℃、30℃、35℃恒溫培養箱中培養48h;培養完成后在-80℃下速凍24h，解凍準備實驗。

　　1.3.3不同接種比例培養：控制培養溫度一致，取OD值均為1的兩菌原菌液1mL，按上述步驟離心洗滌兩次后，加入100mPBS，通過倍比稀釋，將原菌液稀釋至適合濃度后接種。

　　1.3.4乳酸平板食物培養：制作空白酪蛋白食物時，食物滅菌后超凈臺中加入乳酸，振蕩搖勻，乳酸食物濃度分別為25、50、75、100mmol/L，制作平板食物，培養步驟同空白組相同。

　　1.4混合菌落計數

　　檢測平板食物表面發酵后兩菌數量，超凈臺中取發酵后的平板食物1/4，放入盛有10mLPBS緩沖液中震蕩搖勻，取100m，倍比稀釋后注入選擇性固體培養基MRS和麥康凱，涂布均勻后培養計數植物乳桿菌和大腸桿菌數目。

　　1.5果蠅產卵行為檢測

　　實驗選用中空透明圓柱體為雙向產卵裝置，高80mm、直徑60mm，底部放入用于產卵的培養皿[14]。果蠅食物經121℃高壓蒸汽滅菌20min，稍許冷卻倒入平板。將100m無菌水或混合菌群涂布食物表面，密封袋中規定溫度下培養48h。用刀片沿中線切為兩半，無差別拼裝成雙選擇果蠅產卵培養基。每個產卵器中放入黑腹果蠅雌性20只雄性10只，使用酵母平板育肥2-3d;無傷害放入產卵器產卵12h，產卵結束取下食物平板，顯微鏡下計數果蠅胚胎數量。產卵指數(OI)=(實驗組卵數-對照組卵數)/(實驗組卵數+對照組卵數)[12]。

　　1.6存活率實驗

　　使用酵母膏育肥果蠅后將其轉移至產卵裝置中，用葡萄汁瓊脂板(700mLH2O，300mL葡萄汁，30g瓊脂，30g蔗糖)收集8h新產的卵，分別轉移40粒卵對照組和實驗組食物上，在培養箱中規定條件下孵育，每天記錄胚胎成蛹數量及成蛹后羽化數量。存活率=蛹或成蟲數目/總卵數目×100%。實驗重復3次。

　　1.7數據分析與作圖

　　使用Excel軟件整理分析數據，每組數據得平均值(mean)和標準誤(SE)，用SPSS24.0軟件對各處理組間的差異進行t檢驗分析(Studentt-test)。用GraphPad和AdobeIllustrator軟件完成相關圖的制作。

　　2結果和分析

　　2.1混合菌影響果蠅產卵偏嗜性

　　分別將植物乳桿菌、大腸桿菌和二者1：1混合涂布到果蠅食物上，37℃培養48h，處理后食物與對照組食物拼接成雙選擇產卵地點，分別檢測上述三種處理對果蠅產卵偏嗜性的影響。實驗結果顯示，雌性野生型果蠅OregonR(OR)將88.5%卵產在植物乳桿菌培養的食物一側，產卵指數(ovipositionindex，OI)為0.77，說明植物乳桿菌可吸引果蠅產卵。相反，果蠅將90%卵產在大腸桿菌培養的食物一側，OI為-0.80，說明大腸桿菌排斥果蠅產卵。

　　以上結果說明不同種細菌可以引起果蠅截然相反的產卵偏好性。另一個野生品系CantonS(CS)對植物乳桿菌、大腸桿菌處理后食物的OI分別為0.81和-0.84，與上述OR果蠅產卵偏嗜性一致，可排除果蠅遺傳背景的影響，也與包括我們在內的前人報道相一致[8,13]，說明這種產卵偏嗜性為果蠅特有的行為。這兩種細菌可分別作為吸引和排斥果蠅產卵的代表性菌株，為研究混合菌群影響果蠅產卵偏嗜性提供了很好的素材。首先等比例混合植物乳桿菌和大腸桿菌，然后將混合菌接種到果蠅食物，檢測果蠅產卵偏嗜性。

　　結果發現，當植物乳桿菌與大腸桿菌等比例時，果蠅的OI為-0.46，介于兩者單純培養的OI之間，仍然具有強烈的產卵避性，說明大腸桿菌排斥產卵效應占據優勢，大于植物乳桿菌吸引產卵效應，最終表現出果蠅產卵避性。同樣，植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合引起CS果蠅產卵避性，果蠅的OI介于兩者單純培養的OI之間。以上結果說明，純菌株和混合菌可作為重要因子而影響果蠅產卵偏嗜性。

　　3討論

　　自然界或生物體內都存在著大量的微生物，它們復雜且多樣，在空間上和時間上都是動態變化的。在菌群中細菌個體間在不斷發生著信息交流，影響微生物群落的平衡。在菌群中不僅有群落內部的交流，細菌也會和外界進行信息交流，對外界不斷變化的環境條件做出反應，協調各自基因的表達，實現動態平衡[15]。

　　揭示影響菌群平衡的因素對理解和調控菌群平衡具有重要的研究價值。以益生菌植物乳桿菌與條件致病菌大腸桿菌構建研究模型，研究影響菌群平衡的因素以及對果蠅的產卵行為的影響。首先，在37℃，黑腹果蠅對植物乳桿菌和大腸桿菌具有產卵趨向性和產卵避性，將植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合時，OI為-0.46，介于兩者單獨培養的OI之間，仍具有產卵避性。改變細菌的初始接種比例可以改變甚至逆轉果蠅的產卵偏嗜性。

　　在初始接種數量增加到一定程度時，即使在相同條件下生長情況處于劣勢，也會逆轉劣勢成為優勢菌。菌群中細菌占據數量優勢成為優勢菌之后，對果蠅的產卵效應也占據優勢。混合菌中植物乳桿菌和大腸桿菌的最適生長溫度不同，因此我們推測溫度也是影響菌群平衡的重要因素。25℃，植物乳桿菌與大腸桿菌等比例混合時，果蠅OI為0.41，表現出吸引效應，與35℃時恰好相反。此時菌落數量也顯示植物乳桿菌數量占據優勢，說明溫度影響植物乳桿菌與大腸桿菌的相互競爭，低溫能賦予植物乳桿菌以競爭優勢。并且接種比例與溫度能互作而影響果蠅產卵偏嗜性，低溫和接種數量優勢下OI要高于兩者單獨情況下的OI。

　　在有限的空間和資源下，菌群中不同細菌會形成不同的社會關系，其中最為顯著的便是共生與競爭，在共生中細菌間既有求同也有存異[16]，而在競爭中細菌之間為爭奪有限的空間和資源，可以抑制甚至殺死其他微生物[17]。混合菌中益生菌植物乳桿菌和條件致病菌大腸桿菌呈相互競爭狀態，植物乳桿菌可抑制大腸桿菌的生長。在30℃，發現植物乳桿菌的代謝產物，特別是乳酸可以抑制大腸桿菌的生長，而植物乳桿菌滅活細胞則不具備這種作用。植物乳桿菌的代謝產物能影響混合菌的生長平衡，繼而調控果蠅產卵的偏好性。微生物能提高果蠅后代的存活率[18]，混合菌中植物乳桿菌占據優勢時，蛹存活率顯著提高，而大腸桿菌占據優勢時蛹存活率極低，混合菌群的平衡能影響果蠅后代的存活率。

　　我們的研究結果表明，接種比例和溫度是影響菌群平衡的重要因素，而菌群平衡能調控果蠅的產卵行為，影響其后代的存活率。本研究闡述了影響菌群平衡的重要因素以及混合菌群互作的機制，為混合菌群方面的研究做了很好的鋪墊，具有重要的理論意義。通過改變一些外部條件來調節菌群的生長平衡，使菌群朝著有利于宿主的方向生長是一個很好的利用菌群的思路。

　　參考文獻

　　[1]HibbingME,FuquaC,ParsekMR,PetersonSB.Bacterialcompetition:survivingandthrivinginthemicrobialjungle.NatureReviewsMicrobiology,2010,8(1):15-25.

　　[2]JiaX,Dini-AndreoteF,FalcãoSallesJ.Communityassemblyprocessesofthemicrobialrarebiosphere.TrendsinMicrobiology,2018,26(9):738-747.

　　[3]BroderickNA,LemaitreB.Gut-associatedmicrobesofDrosophilamelanogaster.GutMicrobes,2012,3(4):307-321.

　　作者：王子光1#，門捷2#，張津1，黃永存3*，劉威2,4*

轉載請注明來自發表學術論文網：http://www.zpfmc.com/nylw/28773.html