化學(xué)氧化強(qiáng)化生物堆修復(fù)石油污染土壤研究

　　摘　要：生物修復(fù)技術(shù)是一種成本較低且環(huán)境友好的可持續(xù)發(fā)展修復(fù)技術(shù)，但是其所需的修復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)。采用化學(xué)氧化強(qiáng)化生物堆修復(fù)石油污染土壤的方法探究其修復(fù)效果并采用BIOLOG ECO板和高通量測(cè)序技術(shù)探明微生物群落的響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明，通過(guò)240 d的生物堆修復(fù)，生物修復(fù)(NP)和氧化劑強(qiáng)化生物修復(fù)(NP_O)處理使土壤中總石油烴從30649mg·g–1分別下降至5889mg·g–1和2351mg·g–1，化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)后的土壤石油烴濃度低于國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)管制值(GB 36600—2018)。BIOLOG ECO微孔分析和高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，氧化劑處理的土壤中微生物活性迅速恢復(fù)，且化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)處理中具有石油烴降解潛力的菌屬M(fèi)icrobacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045是該處理的主要細(xì)菌標(biāo)記物。

　　關(guān)鍵詞：石油污染土壤;化學(xué)氧化;生物修復(fù);16s rDNA;細(xì)菌群落

　　石油作為重要的能源化工原料，在其開(kāi)采、運(yùn)輸、加工和使用過(guò)程中進(jìn)入土壤環(huán)境，造成嚴(yán)重的土壤污染[1]。石油進(jìn)入土壤后，會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，降低氮磷等有效土壤養(yǎng)分。石油烴作為石油中的主要污染物，主要包括烷烴和芳香烴。這些污染物可通過(guò)揮發(fā)或食物鏈富集等途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此，石油污染土壤亟待修復(fù)。常用的石油污染土壤修復(fù)方法主要包括物理、化學(xué)和生物修復(fù)。其中生物修復(fù)是一種修復(fù)成本較低且環(huán)境友好的可持續(xù)修復(fù)技術(shù)[2]。該技術(shù)利用微生物代謝，達(dá)到降解污染物的目標(biāo)[3]。

　　但生物修復(fù)后期難降解污染物，如高環(huán)芳烴、長(zhǎng)鏈烷烴等及有毒含氧中間產(chǎn)物會(huì)抑制微生物活性，影響微生物代謝，從而降低修復(fù)效率[3-4]。化學(xué)氧化修復(fù)是利用化學(xué)氧化劑(如芬頓試劑、高錳酸鉀、過(guò)硫酸鈉等)快速降解污染物的技術(shù)方法[5]。化學(xué)氧化劑在對(duì)總石油烴(total petroleum hydrocarbons，TPHs)等有機(jī)污染物氧化過(guò)程中，能夠?qū)㈤L(zhǎng)鏈烷烴降解成短鏈烷烴，并且不受土壤生物毒性影響，從而去除污染物。完全采用化學(xué)氧化修復(fù)成本高，且會(huì)對(duì)土壤造成二次污染。但是采用適量的化學(xué)氧化劑強(qiáng)化生物修復(fù)能克服上述單一修復(fù)技術(shù)的局限，有效提高修復(fù)效率[6-8]。

　　過(guò)硫酸鈉具有溶解度大、穩(wěn)定性好、pH適應(yīng)范圍廣以及修復(fù)后土壤微生物活性可恢復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，成為強(qiáng)化生物修復(fù)的主要化學(xué)氧化劑[9]。如羅俊鵬等[10]研究表明氧化劑強(qiáng)化生物修復(fù)能夠有效提高土壤中有機(jī)污染物的去除效率。本研究采用生物堆對(duì)江蘇油田某石油污染進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)后期采用過(guò)硫酸鈉對(duì)石油污染土壤進(jìn)行氧化，研究其進(jìn)一步強(qiáng)化生物修復(fù)的效果。并探究不同處理對(duì)TPHs的去除效果與微生物活性和群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，為化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)石油污染土壤提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1 儀器和試劑

　　儀器：GC-FID(Agilent 7890B，美國(guó))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，酶標(biāo)儀等。試劑：過(guò)硫酸鈉(Na2S2O8)為分析純;正己烷(nHexane，C6H14)、二氯甲烷(dichloromethane，CH2Cl2)均為色譜純;無(wú)水硫酸鈉(分析純，400℃活化6 h)、弗羅里硅土(60～100目，層析用;400℃活化6 h)。

　　1.2 供試土壤

　　石油污染土壤取自江蘇油田，TPHs含量為30649mg·kg–1，pH為8.01。

　　1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　生物修復(fù)采用生物堆。生物堆反應(yīng)器為160 L。堆肥處理中按油泥質(zhì)量的12%添加豬糞，3%添加稻草秸稈。具體操作為在油泥中添加豬糞和稻草秸稈后充分?jǐn)嚢杈鶆颍�堆肥桶外裹上保溫膜，底部接滲漏液出口管，加水調(diào)節(jié)堆體初始含水率為50%左右，定期翻堆通風(fēng)與添加水分。將溫度計(jì)插入堆體中，每天記錄下溫度。為避免油泥中污染物分布不均勻，采取多點(diǎn)取樣混合法進(jìn)行采樣，分別于堆肥的第0、40、80、120、160和240 d采樣。每次取樣50 g，將采集到的樣品凍干，研磨后過(guò)60目篩，使用GC-FID測(cè)TPHs含量，于第240 d檢測(cè)土壤中土壤微生物活性、群落結(jié)構(gòu)與多樣性。處理如下：

　　(1)對(duì)照(Control)：70 kg油泥;(2)生物修復(fù)(NP，添加氮磷的生物修復(fù)處理)：70 kg油泥+8.4 kg豬糞+2.1 kg稻草;(3)氧化劑強(qiáng)化生物修復(fù)(NP_O，在NP基礎(chǔ)上氧化劑強(qiáng)化)：70 kg油泥+8.4 kg豬糞+2.1 kg稻草+氧化試劑。氧化劑于堆肥的第160 d加入50 mmol/kg 過(guò)硫酸鈉和 10 mmol/kg 硫酸亞鐵，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笕�樣測(cè)TPHs濃度。

　　1.4 TPHs的提取及檢測(cè)

　　稱(chēng)取凍干土樣(60目)2 g，以二氯甲烷作為萃取劑，采用索氏提取法于54℃水浴提取石油烴16～18 h。將提取液旋蒸濃縮后通過(guò)含有4 g弗羅里硅土和1 g無(wú)水硫酸鈉的玻璃砂芯層析柱凈化，用色譜純正己烷洗脫凈化的石油烴，將凈化的的洗脫液濃縮至2 mL后用GC-FID進(jìn)行檢測(cè)，氣相色譜條件采用中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)《土壤和層積物石油烴(C10~C40)的測(cè)定氣相色譜法》(HJ 1021—2019)。

　　1.5 碳素利用法(Biolog法)分析微生物活性

　　本研究采用Biolog ECO板對(duì)各處理土壤的微生物群落代謝活性進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取相當(dāng)于5 g干土的新鮮土樣，于裝有50 mL 0.85%NaCl無(wú)菌溶液中，在30℃震蕩培養(yǎng)箱中以150 r·min–1的速度振蕩30 min，靜置15 min后，取上清液稀釋100倍。Biolog ECO板的每個(gè)孔中分別加入稀釋液150 μL，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，期間每24 h于酶標(biāo)儀中采用590 nm測(cè)定吸光度。采用31個(gè)孔的吸光度平均值(average well color devel-opment，AWCD)來(lái)表征微生物的平均活性。

　　1.6 高通量測(cè)序

　　稱(chēng)取新鮮土壤樣品0.5 g，采用土壤DNA提取試劑盒(Fast DNA® Spin Kit for Soil，MP Biomedicals，USA)，按照試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)提取土壤DNA。將土壤DNA樣品送至中國(guó)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，由其采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，采用質(zhì)量均一化后的PCR產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)并在Illumina-Miseq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的序列降噪后按照97%相似度進(jìn)行運(yùn)算分類(lèi)單位(operationaltaxonomic units，OTU)劃分，采用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU的分類(lèi)信息進(jìn)行比對(duì)。

　　按照本研究樣本中最少序列數(shù)27876抽憑，然后采用抽憑后的數(shù)據(jù)計(jì)算微生物群落多樣性指數(shù)，包括Shannon、Chao、Invsimpson和ACE。采用主成分分析(principal componentanalysis，PCA)研究各處理間及各處理內(nèi)細(xì)菌群落組成的相似性和差異性。采用LEfSe軟件進(jìn)行線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)研究各處理中具有顯著富集的菌屬。

　　1.7 數(shù)據(jù)處理

　　采用R對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及作圖，各個(gè)處理之間的差異采用鄧肯式多重方式比較(p<0.05)。

　　2結(jié)　果

　　2.1 土壤修復(fù)過(guò)程中TPHs的變化

　　生物堆修復(fù)能夠顯著降低土壤中TPHs含量。經(jīng)過(guò)240 d的修復(fù)， NP和NP_O處理土壤中TPHs含量由30649mg·kg–1分別下降至5889mg·kg–1和2351mg·kg–1。全部達(dá)到工業(yè)用地標(biāo)準(zhǔn)4500mg·kg–1，并且在NP_O處理中，化學(xué)氧化能夠進(jìn)一步強(qiáng)化土壤中TPHs的去除。

　　2.2 土壤修復(fù)過(guò)程中微生物活性與數(shù)量的變化

　　相較于對(duì)照組(Control)，生物修復(fù)處理組(NP、NP_O)顯著增強(qiáng)了微生物群落的代謝活性。并且，相較于NP處理組，氧化劑處理80 d(修復(fù)的第240 d)后， NP_O組中微生物代謝活性幾乎未受到氧化劑的影響。

　　2.3 土壤修復(fù)過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的變化

　　2.3.1細(xì)菌群落多樣性變化

　　主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)。各處理內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，各處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著分異。化學(xué)氧化處理(NP_O)和未氧化處理組(Control和NP)分別位于PCoA1軸的負(fù)向和正向兩端;而生物堆處理組(NP、NP_O)和對(duì)照(Control)被PCoA2軸分開(kāi)，分別位于正向端和負(fù)向端。各處理中土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)。Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照處理(Control)，生物修復(fù)處理(NP、NP_O)顯著降低了土壤中細(xì)菌的多樣性，且采用化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)處理(NP_O)進(jìn)一步降低了土壤中細(xì)菌多樣性。

　　2.3.2細(xì)菌群落分類(lèi)

　　細(xì)菌群落門(mén)和屬水平上相對(duì)豐度結(jié)果。化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)處理顯著降低了細(xì)菌群落在門(mén)水平上的多樣性。在修復(fù)各處理中，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，對(duì)照組(Control)、NP和NP_O中依次為68.35%、67.22%和76.35%，其中Gammaproteobacteria最為優(yōu)勢(shì)，并且其相對(duì)豐度在生物修復(fù)的處理中顯著增加。化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)提高了Bacteroidetes的相對(duì)豐度。

　　在屬水平上，采用熱圖和LEfSe分別分析了優(yōu)勢(shì)屬和各處理中的標(biāo)記屬。LEFse圖中由中心到外部的圓圈依次表示門(mén)、綱、目、科和屬的級(jí)別，圓點(diǎn)的大小代表微生物的相對(duì)豐度。紅色(Control)、青色(NP)、藍(lán)色(NP_O)圓點(diǎn)表示在其對(duì)應(yīng)顏色的組別中的微生物標(biāo)記物。結(jié)果表明，NP_O處理的主要相對(duì)豐度較高且細(xì)菌標(biāo)記物是Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Porticoccaceae_C1.B045等。其中NP_O處理的Microbacterium(2.47%)、Paracoccus(2.98%)、Pseudomonas(3.51%)、Stenotrophomonas(11.98%)和Porticoccaceae_C1.B045 (2.64%)的相對(duì)豐度均高于其它處理組。

　　3討　論

　　微生物修復(fù)石油污染土壤費(fèi)用較低且對(duì)環(huán)境友好，有利于可持續(xù)發(fā)展。然而，在生物修復(fù)的后期，石油污染物中的長(zhǎng)鏈烷烴由于不易被微生物降解而殘留與土壤中，污染物降解過(guò)程中產(chǎn)生的有毒的中間產(chǎn)物會(huì)抑制微生物活性，導(dǎo)致生物修復(fù)后期降解效率下降，修復(fù)周期延長(zhǎng)。研究表明，化學(xué)氧化能夠有效破壞長(zhǎng)鏈烷烴并快速降解有機(jī)污染物及其中間產(chǎn)物，通過(guò)采用合適的氧化劑能夠使土壤微生物快速恢復(fù)活性，土壤TPHs含量顯著降低[11]。

　　本研究采用化學(xué)氧化強(qiáng)化石油污染土壤生物堆修復(fù)，分析修復(fù)過(guò)程的微生物群落結(jié)構(gòu)變化以探究其修復(fù)效果與修復(fù)機(jī)制的研究結(jié)果表明，生物堆(NP、NP_O)修復(fù)240 d后，土壤中TPHs分別分為5889mg·kg–1和2351mg·kg–1，其中化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)后的土壤石油烴含量低于《土壤環(huán)境質(zhì)量建設(shè)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 36600—2018)中的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)(4500mg·kg–1)。

　　為進(jìn)一步揭示化學(xué)氧化強(qiáng)化生物修復(fù)相關(guān)機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，與NP相比， NP_O處理80 d后，土壤TPHs去除量進(jìn)一步提高，但微生物代謝活性未呈現(xiàn)顯著差異。說(shuō)明添加適量的氧化劑，土壤修復(fù)過(guò)程中微生物活性能夠得到快速恢復(fù)，并使石油烴得以快速去除。

　　這與Zhang等[12]報(bào)道的結(jié)果相一致。為了進(jìn)一步探究細(xì)菌群落與石油烴降解的關(guān)系，本研究利用高通量測(cè)序?qū)��?xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析。PCA表明，影響群落結(jié)構(gòu)變化的主控因素是化學(xué)氧化，產(chǎn)生的自由基具有強(qiáng)氧化性，甚至?xí)�造成�?xì)胞結(jié)構(gòu)損壞導(dǎo)致微生物活性失效[13]，從而使微生物群落結(jié)構(gòu)的豐富度減少，導(dǎo)致微生物群落的多樣性降低。門(mén)水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析顯示，NP_O處理中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度增降低，Bacteroidetes的相對(duì)豐度增加。

　　在門(mén)水平上，與對(duì)照相比，生物堆處理組(NP、NP_O)中Gammaproteobacteria相對(duì)豐度顯著增加，且該處理組石油烴去除率最高。已有研究表明，Gammaproteobacteria是石油污染土壤中降解石油烴的主要功能菌類(lèi)群[14]。盡管生物堆修復(fù)處理組(NP、NP_O)降低了微生物群落的多樣性，但與污染物去除的優(yōu)勢(shì)降解微生物群落多樣性無(wú)關(guān)，主要與土壤中相關(guān)功能菌的增殖有關(guān)，這與課題組前期的研究結(jié)果一致，即石油烴的去除與某種類(lèi)型功能菌的富集有關(guān)[15]。

　　LDA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，屬水平上，Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045是NP_O處理的主要細(xì)菌標(biāo)記物;有研究表明Arthrobacter和Paenarthrobacter屬具有石油降解能力，如Bai等[16]研究證明Pseudomonas和Stenotrophomonas能有效降解烴類(lèi)污染物。許殷瑞等[17]研究發(fā)現(xiàn)，throbacter是石油污染土壤中的主要嗜油屬。另外Hou等[15]的研究數(shù)據(jù)也證明，些菌屬是修復(fù)石油烴污染物的主要細(xì)菌類(lèi)群。說(shuō)明石油烴的降解與這2菌的富集有關(guān)。

　　4結(jié)　論

　　NP和NP_O處理使土壤中TPHs從30649mg·g–1分別下降至4389mg·g–1和1351mg·g–1，修復(fù)后的土壤石油烴濃度低于國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)管制值(GB36600—2018)。BIOLOG ECO微孔分析和高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，氧化劑處理的土壤中微生物活性迅速恢復(fù)，且預(yù)氧化聯(lián)合生物刺激修復(fù)處理中Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045作為主要細(xì)菌標(biāo)記物，多數(shù)具有降解石油烴的能力。該結(jié)果顯示了化學(xué)氧化強(qiáng)化微生物修復(fù)的可行性，為未來(lái)石油烴污染土壤修復(fù)的實(shí)踐應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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　　作者：許科偉1， 顧　磊1， 鄭旭瑩1， 王　彪2,3， 郭　鵬2,3

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