合成生物學在農殘檢測領域的應用

　　摘要：近年來，合成生物學在多個領域嶄露頭角，在農殘檢測中也發揮越來越重要的作用。基于合成生物學模塊化和工程化指導思想，各種基因部件的多樣化組合為農殘檢測提供更多方案。簡便、耐用、低成本、原位檢測等特點也使其較傳統檢測手段具有更強的競爭力。但與此同時，合成生物學在農殘檢測中的應用也受到復雜檢測環境和生物安全性等問題的影響。結合目前合成生物學在有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯和氨基酸甲酯類農藥檢測中的應用與創新實例，歸納合成生物學在農殘檢測中應用的原理，分析并探討合成生物學技術未來在農殘檢測中的發展潛力與應用前景。

　　關鍵詞：合成生物學;農殘檢測;生物反應器;酶;生物技術

　　二十世紀中葉以來，隨著化學品生產工藝的革新，廉價高效的農藥逐漸成為現代農業生產中的“必需品”。世界每公頃耕地面積的農藥使用量(kg/ha)從1990年至2017年增長了70%[1]。在全球范圍內，每年農藥的使用量接近30億公斤，商品估值約為400億美元[2]，這些數據表明農藥的市場十分龐大并不斷擴張。雖然農藥的使用有效地避免了農作物的病蟲害，提高了產量，但隨著農藥的使用范圍不斷擴大，其對于環境的污染和動植物的危害也顯露出來，直接威脅著人類的健康。

　　化學合成農藥是應用最廣泛、毒副作用最顯著的一類農藥，包括有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類等[2]。這類農藥化學性質穩定、半衰期長并且能夠在自然界長期存在并蓄積[3]，從而引起環境污染。據研究報道，在地下水、地表水[4]、土壤[5]、空氣[6]和高海拔地區[7]都能檢測到這類農藥。化學合成農藥還表現出廣泛的毒性，有機磷農藥和有機氯農藥具有強的神經、消化、內分泌、生殖系統等[8-15]毒性。擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類殺蟲劑雖然毒性較小，但也被報道能夠增加多種疾病的患病風險[16-18]。

　　農藥殘留對人類的健康造成了極大的威脅，對其進行有效檢測成為保障人類健康安全的重要環節。但常規的檢測手段操作復雜、等待時間長、檢測成本昂貴[19]，無法滿足農殘原位檢測的需要。因此開發靈敏度高、特異性好、耐用性強的便攜快速檢測方法對微量甚至是痕量的農殘進行有效監控已成為農藥檢測研究領域的熱點及難點之一。合成生物學作為一門新興科學，通過基因編輯手段和工程化思維對生物體進行改造與創新，常被稱作變革性的工具。

　　其獨特的創造性近幾十年來給多個領域和行業帶來了新的生機與活力。以環境修復領域為例，利用合成生物學改造出的菌株能夠有效檢測和降解多種環境污染物[20-22]，其中包括對農藥殘留的檢測。合成生物學能夠將傳統的生物傳感器、農殘誘導操縱子等響應部件和輸出不同信號的報告系統進行多樣化組合，激發傳統生物檢測技術的新潛能，為多種農殘的檢測提供新的思路與方法。原位檢測農殘的特點更是傳統檢測手段無法比擬的，高靈敏度和多輸出信號也打破了農殘檢測的固有局限，拓寬了檢測的應用范圍。對比傳統的檢測手段，本文歸納與總結當前合成生物學技術在農殘檢測領域的應用與創新，分析其具有的優勢與挑戰。

　　1傳統檢測方法

　　目前檢測農藥殘留的傳統方法大致可分為兩類：一類是以色譜法、質譜法、光譜法以及酶聯免疫吸附(ELISA)等方法為代表的常規方法。這些方法能夠提供可靠的分析結果。但操作費時、預處理復雜、成本昂貴且需要使用大量的有機溶劑，因此不適用于針對大量樣品的檢測工作[23]。另一類則是基于各種生物傳感器等先進檢測方法，操作簡單、檢測成本低且適合現場檢測，但高昂的開發成本限制了其在現階段的應用。

　　1.1傳統的波譜檢測技術

　　1.1.1氣相色譜法

　　氣相色譜(GC)適用于分析非極性、易揮發且易汽化的化合物。其通常與特定的檢測器結合用于不同農藥檢測，表現出了優異的性能[24]，如電子捕獲檢測器(ECD)適用于檢測鹵代化合物，火焰光度檢測器(FPD)主要用于測定含硫和磷的農藥化合物，氮磷檢測器(NPD)對含有氮和磷的農藥有極高的選擇性，而火焰離子化檢測器(FID)則幾乎適用于各種農藥的檢測[25]。

　　1.2酶聯免疫吸附法

　　酶聯免疫吸附(ELISA)法因其低成本、操作簡單等優點而被格外重視。該方法基于抗原-抗體間的特異性相互作用，因此能為某些農藥提供特異性極高的檢測結果。同時，該方法能夠一次性裝載大量樣品，極大地簡化了樣品的處理程序[27]。單鏈抗體(scFvs)和納米抗體(VHHs)等小抗體與特定蛋白進行融合產生的新型酶聯免疫吸附方法也開始出現[28,29]，常見的設計為抗體-堿性磷酸酯酶(AP)融合體。

　　這種融合表達設計能夠省去二抗的步驟，是一種簡單快速的競爭性酶聯免疫吸附測定方法。該法已被應用于擬除蟲菊酯類農藥[28,30,31]、有機磷類農藥[32-34]的檢測。但該技術特異性較差，對于特定農藥檢測的專一性不夠強，無法勝任未知樣品的農殘檢測[35]。

　　1.3毛細管電泳法毛細管電泳法(CE)對樣品量要求較低、分離效率高且耗時短。但毛細管內徑較小，在檢測中只允許少量進樣，因此在靈敏度方面有一定的欠缺，一般與高靈敏度的檢測方法(如MS)聯用以彌補不足[36]，或者通過更高效的樣品濃縮方法來提高檢測的靈敏度[37]。該方法與色譜法及ELISA相比，進一步提高了檢測效率并降低了成本。

　　1.4表面增強拉曼光譜法表面增強拉曼光譜(SERS)法具有快速測定食品中農藥殘留的能力，其靈敏度極高且操作方便。目前已經開發出多種SERS檢測方法：原位SERS方法，可直接檢測植物表面的農藥殘留[38,39];以納米銀粒子為基質的SERS方法無需樣品處理即可檢測飲料樣品[40];結合表面拭子的SERS方法可對水果表面殘留的農藥進行檢測[41]。但使用該方法需建立不同農藥分子的光譜數據庫，并對農藥的代謝物、轉化產物等進行光譜學的研究。

　　1.5傳統的無細胞生物傳感器法傳統的無細胞生物傳感器基于配體-受體特異性結合的原理，將待檢測物的含量、種類等信息通過不同的方法轉化為各種信號，從而達到定量檢測的目的[42-47]。這類方法與前述的方法相比集成度高、簡單便攜且不依賴于精密儀器。

　　2應用于農殘檢測的合成生物學

　　近年來合成生物學模塊化、工程化思想逐漸應用于農殘檢測領域，本節將結合目前合成生物學在農殘檢測領域的應用，對其應用原理進行介紹。

　　2.1全細胞生物傳感器

　　合成生物學技術可以在細菌體內構建模塊化基因回路并建立起能夠檢測特定類型農藥的全細胞生物傳感器。生物傳感器的構建不再需要純化蛋白的復雜步驟，而是將整個細胞作為檢測器，大大節省了時間和成本。

　　2.1.1表面展示水解酶

　　當前研究已報道了多種能夠降解特定農殘的酶，如有機磷水解酶(OPH)[48]、甲基對硫磷水解酶(MPH)[49,50]、γ-六氯環己烷脫氫氯酶[51]等。這些酶能夠將農殘降解為更易于檢測的小分子或特征化合物，通過檢測降解產物可以間接測定農殘含量。

　　這些酶的發現及其基因鑒定是合成生物學的改造基礎。農殘降解酶通常存在于土壤微生物體內，但這些微生物往往繁殖能力弱、對生長環境要求高、產酶效率低，不適合作為全細胞生物傳感器的底盤細胞。合成生物學技術將原始宿主菌體內的降解途徑轉移到易于進行基因操作的細菌體內，成功構建出高效的農殘檢測工程菌株[51]。同時為了避免農藥低效的跨膜轉運及轉運的損失，常通過表面展示系統將降解酶表達在菌體表面，利用體外催化的方式實現對農殘的降解與檢測[52-54]。除催化型的生物傳感器外，近些年利用重組基因技術在菌體表面展示抗體的農殘檢測方法也開始出現[55]。

　　2.2無細胞合成生物學

　　無細胞合成生物學指的是構造的工程化回路在無細胞底盤的類細胞系統中(含有細胞表達的必需成分)進行轉錄與表達[60]，其能精準控制各組分的混合比例，與簡單的數學建模相結合，檢測更加準確。無細胞合成生物學的出現，規避了基因修飾微生物(GeneticallyModifiedOrganisms,GMOs)的釋放，避免了生物安全性問題[61]，使得合成生物學應用于農殘的現場檢測更為安全，更具實用性。

　　3合成生物學在農殘檢測中的應用

　　3.1合成生物學應用于有機氯農藥的檢測

　　有機氯農藥(OCs)是一類半衰期長的合成有機化合物，常見的有機氯農藥有二氯二苯基三氯乙烷(DDT)，林丹(γ-HCH)，阿特拉津，β-六氯環己烷(β-HCH)等。由于使用廣泛和半衰期較長，OCs已成為環境中普遍存在的污染物[63]。對于有機氯農藥，目前的主要檢測方法是氣相色譜-質譜法、固相萃取色譜法等復雜精細的方法，這些方法費時又昂貴，不適于現場檢測。近些年來針對此類農藥，已經開發出一些極具潛力的合成生物學檢測方法。

　　3.1.1代謝礦化作用

　　檢測有機氯農藥的主要思路是將難以直接檢測的有機物初步代謝為易于檢測的化合物。研究表明γ-六氯環己烷氯化氫酶通過三步脫氯作用，可初步降解林丹γ-HCH，并釋放三個HCl分子。聚苯胺的質子化程度及其電導率隨pH的降低而增加，將HCH脫氯化氫酶(LinA2)基因導入大腸桿菌中表達，并將工程菌固定在可檢測pH變化的聚苯胺基質中，施加0.4V電勢時，電流可隨pH的降低(HCl分子的產生)而增加，因而構建出高靈敏度、選擇性強的林丹(γ-HCH)全細胞傳感器[51]。

　　4結語

　　合成生物學作為一門新興學科，在短短十多年間已經取得了眾多突破性的進展。目前研究者們已經構建了大量在實驗室范圍內可用的全細胞生物傳感器，也開發了一些更具實際應用優勢的無細胞合成生物學檢測方法，在多種農藥的特異性檢測方面取得一定的研究成果。這些傳感器大多通過設計巧妙的特異性響應，使得在特定農藥分子存在時出現易于監測的陽性信號，大大方便了農殘檢測[20]。

　　相比傳統方法，這些新方案存在諸多優勢，其不需要大而昂貴的精密儀器，也不需要復雜的運輸和前處理過程，更加具有現場檢測、原位監測的潛力，在商業化上也更有成本優勢。但是，合成生物學在在農藥檢測中的應用尤其是全細胞傳感器仍然面臨著眾多挑戰。全細胞生物傳感器一般無法達到化學檢測的精度，而且在很多情況下由于報告基因的表達所需的時間而造成延長響應，此外如何在營養缺乏甚至是含毒性化合物的環境下保存細胞活力也是必須考慮的問題[88]。

　　生物學教學論文：淺談高中生物學科核心素養培養對策

　　針對上述問題，研究人員試圖通過精制宿主植株[89]、設計更敏感的啟動子[90]、使用表面展示的蛋白[91]等提高微生物傳感器的特異性、敏感性并減少響應時間[92]。選擇水凝膠[93]等材料進行封裝，提升安全性同時方便儲存。近年來各種各樣的合成生物學檢測方案正在進行從實驗室走向實際推廣應用的嘗試。一方面這需要克服前文提到的檢測限、特異性和培養條件等限制，另一方面也必須考慮生物安全問題。這不僅要求研究人員加強生物控制，也要求在應用前對微生物衍生傳感器對生態環境和人類健康的潛在影響進行更系統的評估[88]。在未來，微生物傳感器也將向著更自動化、更精細的無細胞系統發展，具有廣大的前景[89]，合成生物學勢必在其中起到關鍵性的作用。

　　參考文獻

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　　作者：毛金竹1,3，肖淑玲1,2，楊智淳1,2，王孝宇1,4，張詩1,5，陳俊宏1,2，謝佶晟1,2，陳福德1,2，黃子諾1,2，馮天宇1,2，張璦琿1,2,6，方柏山

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