計算機輔助篩選核酸適配體技術

　　摘要:計算機信息技術已經滲透到我們生活的方方面面，不僅可以輔助藥物的篩選，也能夠模擬藥物的作用。目前已有研究使用計算機輔助技術篩選適配體，對篩選效率的提升和篩選高親和力的適配體有著重要的指導作用。文中將主要對計算機通過序列評估、結構分析、分子對接3個方面輔助適配體篩選的方法進行綜述。

　　關鍵詞:適配體，指數富集的配體系統進化技術，計算機輔助篩選，序列評估，結構分析，分子對接

　　核酸適配體是指一種能夠與特定目標物發生高親和力和特異性結合的寡核苷酸片段，通過配體指數富集的配體系統進化技術(Exponentially enrichedligandsystemevolution，SELEX)從隨機文庫中篩選獲得的功能性核苷酸，大小一般約為6–40bp，具有一些特殊的二級結構，如發夾、莖環、假結、G-四聯體等，能讓適配體可以形成多種三級結構，使其能夠與靶物質結合。

　　1990年Tuerk等[1]就首次通過SELEX從65536個序列的預測池中篩選出了兩個不同的序列，它們可以與T4DNA聚合酶相互作用。經過數十年的改進，SELEX技術已經成為一種重要的研究方法和工具，其基本原理是體外化學合成一個單鏈寡核苷酸庫，包括大量隨機單鏈DNA或RNA(1016–1018個單鏈)，用它與靶物質(包括金屬離子、小分子、大分子、細胞、組織以及混合靶標等)混合，同時洗脫混合液中未與靶物質結合的核酸，保留與靶物質結合的核酸分子，隨后分離與靶物質結合的核酸分子，再以此為模板進行PCR擴增，進行下一輪篩選。

　　通過重復篩選，一些與靶物質不結合的、親和力不理想的適配體就會被洗脫，而具有高親和力的適配體就能從1016到1018的隨機文庫中分離出來，且理論上該序列的純度隨著SELEX的不斷篩選將會越來越高，最后庫中序列大部分都是高親和力序列[2]。這些高親和力序列的結合具有高特異性，且可選的靶分子廣泛，已經在基礎研究、臨床診斷和治療中顯示出了廣闊的應用前景。核酸適配體還有著相對簡單的化學結構，使其易于體外合成和修飾[3]，允許在寡核苷酸上的特定位置插入電化學或熒光報告分子以及表面結合劑。

　　在適配體和靶物質結合過程中，核酸適配體的構象變化可以用來產生分析信號。許多以適配體為基礎的生物傳感器已經成功用于測量蛋白質的細胞分泌，但實際篩選過程卻不易得到高親和力的序列。在眾多候選的序列中挑選出潛在的高親和力序列，成為了許多適配體研究者的一大困擾。目前通過X光晶體衍射[4]以及核磁共振[5]，科學家們已經分析了較多適配體的空間結構，并成功解析了許多適配體與靶分子間的作用機制，這些來之不易的研究成果為后續各種生物信息學工具奠定了基礎。

　　與此同時，隨著計算機和信息技術高速發展，已有許多計算機輔助天然藥物篩選的例子，同時也有越來越多的研究者發現通過計算機輔助能提升適配體篩選的效率和提高得到高親和力序列的概率，該技術可能對適配體未來的發展產生巨大的影響。本文將著重對計算機輔助適配體篩選相關方法以及它們的主要應用和相關結果進行分析，同時對它們的優缺點進行比較，并對近年來該領域的一些創新應用進行綜述。

　　1SELEX技術目前存在的缺陷和發展

　　1.1SELEX技術目前存在的缺陷

　　1.1.1需要極大的初始文庫容量核酸適配體篩選初始文庫的隨機序列一般有30–60個堿基。因此理論上初始文庫容量為 1018–1036，但因目前核酸合成的最大庫容量只能達到1016，實際與理論庫容量相比相差很大[6]。

　　1.1.2篩選流程較為繁瑣整個篩選流程耗時長、精力投入大，且無法確定具體篩選的次數，一般需要十幾輪篩選才能夠篩選出親和力較好的序列，武漢大學基礎醫學院的章曉聯團隊總共進行了17輪篩選，才得到了鳥分枝桿菌的適配體[7]。

　　1.1.3難以篩選出親和力較高的序列正如Kanagawa所指出的，核酸適配體結構越復雜，其與靶標結合的親和力越高，但由于PCR具有偏好性等原因[8]，導致一些富含GC堿基的序列更容易被擴增，使原本豐度不夠大的文庫結構變得更加單一，導致某些高親和力的序列在庫中的含量越來越低，造成篩選次數增加，親和力反而下降的現象。

　　1.1.4后期處理工作十分復雜且易錯過高親和力序列在測序、分析、篩選出合適的序列后，還需要再將其合成進行重復驗證。如果要鑒定更多序列，不僅成本高，還需要投入大量時間。所以考慮到成本問題，大多數情況下還只能合成極少量的序列，因此很容易錯過真正有親和力的序列。

　　1.2SELEX技術的發展

　　針對以上幾個問題，2004年Mendonsa等提出了毛細管電泳SELEX這項技術，因其無需固定相和洗脫的緣故，大大減少了篩選的次數[9]。

　　隨后也誕生了無需對靶物質進行詳盡分析并且能夠發現更多潛在靶點的細胞SELEX技術;還有無需Sanger測序分析，能在所有篩選輪中對庫進行排序的高通量SELEX(Highthroughputsystematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，HT-SELEX)[10]。HT-SELEX不僅減少了篩選次數，有效地降低了PCR偏好性帶來的誤差，還能完全自動化操作，提高了篩選效率，甚至有望取代常規的SELEX。該技術如此快速的發展，離不開計算機的輔助：通過強大的生物信息學工具，對大量數據進行全面的分析，并對結合能力以及結構進行預測，再量化豐度，模擬適配體與靶物質的相互作用，進一步綜合分析得到的適配體，盡可能地保留有價值的序列。

　　2計算機輔助篩選適配體的方法與工具

　　目前越來越多的生物信息學工具開始在生物學研究上嶄露頭角，它們推動了核酸適配體的研究，使得研究者們能夠在進行生物活性篩選之前，利用計算機對所需的環境進行模擬，得到靶分子和配體在該環境下最有可能的結構，再利用分子對接軟件模擬目標靶點與候選分子之間的相互作用，計算其結合能并評估結合程度，以此來篩選出高親和力的適配體。且經過不斷的研究和改良，已經可以通過設計算法程序對HT-SELEX產生的大量序列進行打分，評價其富集的程度以及結合的潛力，再折疊出其中的高分序列最有可能形成的二級結構，利用多種軟件預測該高分序列的三級結構，用于之后的對接驗證。下面將主要介紹如何通過計算機評估序列、分析適配體結構和分子對接的方法輔助適配體的篩選。

　　2.1通過評估序列輔助篩選

　　核酸適配體能夠識別特異的靶物質，很大程度上是因為其獨特的三維結構。序列本身的堿基排列順序就能夠對后續的三級結構的折疊產生巨大影響，可能僅僅幾個堿基的不同適配體三級結構就會有很大的差異，導致親和力會有很大的不同。高親和力適配體的堿基排序必然具有一定的特殊性。為了更好地了解某些特殊結構與序列的關系，科學家們也開始把核酸適配體相關的常見模體(例如G-四聯體[11]、發夾、莖環)收錄進數據庫中，方便后續利用計算機分析這些特異的結構與序列之間存在的規律。

　　例如，2000年KensakuSakamoto團隊[12]開發了針對發夾的算法，隨后Gorodkin設計了能夠分析RNA序列中的莖環結構的Stem-LoopAlignSearcH[13]。此后，由于發現四聯體在重要的生理過程中不可或缺并且在作為治療靶標的應用也有著非常重要的作用，使得它受到了廣泛的關注。為了進一步研究四聯體的序列的特點，Kikin等[14]在2006年用PHP編寫了基于Web的程序QGRSMapper(http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/)，該web可用于預測核苷酸序列中形成四聯體的富含鳥嘌呤的序列。

　　后來也有不少團隊利用QGRSMapper來研究具有四聯體結構的核酸適配體。例如，為了獲得血管內皮生長因子的高親和力適配體，KazunoriIkebukuro[15]團隊利用QGRSMapper分析了它們篩選出適配體Vap7中可能存在的四聯體結構，并利用圓二色譜法驗證了該序列中穩定的四聯體結構，最后通過優化四聯體的結構成功得到了親和力更高的適配體。Zheng等[16]也通過QGRSMapper分析了石房蛤毒素的適配體，發現該適配體也存在穩定的四聯體結構，篩選出了四聯體結構最為穩定的適配體，之后通過保留四聯體相關的序列，截短多余的序列，成功得到了STX的高親和力適配體。

　　它們雖然較好地分析出了序列中某種特殊模體的穩定性和可能性，能夠在序列數量不多的情況下篩選出分數最高即最能夠穩定形成上述特定結構的序列，但是它們只能針對一種特定的特殊模體進行分析，不能夠分析序列中存在多種特殊模體的可能性。這就需要我們對適配體與靶物質的作用模體有一定的了解，才能夠保證高效無誤地篩選出具有親和力的適配體。且這類早期的算法只能輸入較少的序列，因此很難應用到大量數據的處理上。所以，為了能夠分析類似于HT-SELEX產生的大量且無序的數據，就需要設計新的算法對這些序列進行多次的聚類和分類[17]。

　　3計算機在適配體上的創新應用

　　隨著計算機在適配體上的應用逐步推廣，以及計算機科學技術的飛速發展，人工智能逐步興起，目前已有研究者將機器學習應用到了SELEX上。在2020年新冠病毒爆發的這段時間里，廈門大學楊朝勇教授為了從大量序列數據中得到高性能的刺突蛋白適配體。設計開發了一款新的序列多維分析算法SMART-Aptamer，通過無監督機器學習過程，來識別適配體家族并跟蹤適配體家族大小的動態變化。

　　以SARS-CoV-2的刺突蛋白作為研究對象，為了篩選出能夠具有中和作用的S蛋白適配體，在原本的正篩選和反篩選的基礎上，額外的考慮了與ACE2的競爭作用，更重要的是在該過程中使用了SMART-Aptamer，該算法考慮到了ACE2競爭壓力，成功地利用了可變選擇壓力研究了其進化譜系。最后成功得到了高親和力的適配體CoV2-RBD-1和CoV2-RBD-4[41]。

　　該類適配體為SARS-CoV-2的診斷和治療提供新的思路，同時也為深入研究冠狀病毒感染的機制提供了新的工具。計算機不僅能夠應用到SELEX的流程中，還能夠應用在初始文庫的設計上。由于初始文庫是核酸適配體篩選的源頭，作為SELEX中最重要的一環，如果設計不合理，必然會影響到篩選的結果[42]。因此越來越多的研究者開始重視初始文庫的設計，開始利用計算機設計初始文庫。

　　例如，在已知某二級結構與適配體的親和力密切相關時，就可在核酸適配體數據庫中[43]挑選目前已知的核酸適配體，再利用二級結構的預測軟件諸如Mfold等[44]對挑選出的序列進行預測，由此從龐大的數據庫中篩選出具有該特殊結構的適配體，構建出一個新的初始文庫，不僅定向增加了含有該結構的適配體，還可保留天然適配體中的高級結構。Luo等[45]利用相同的思路，對隨機文庫中的結節進行統計，并對非引物部分進行隨機突變來增加文庫豐富程度，最后獲得的RFPoolA文庫，經過驗證，相較于普通的隨機文庫，其高級結節的結構含量有明顯增加。

　　2016年，Xu等[46]對已有的前列腺特異性膜抗原適配體進行二級結構的預測，再通過分子對接軟件綜合比較確定了其作用的關鍵結構，然后在此結構的基礎上，對已有的核酸適配體進行單點突變、截斷以及插入，通過該方法得到了一個新的文庫，最后利用三維結構預測軟件Vfold3D[47]進行結構預測。通過分子對接進行親和力的驗證，最終成功獲得了親和力更高且較短序列的適配體。由此表明，分子模擬技術應用于初始文庫的設計，確實對于提高適配體親和力以及篩選效率有明顯的效果和應用潛力。

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　　4總結與展望

　　有著巨大潛力的計算機技術為適配體的研究帶來了福音，不同種類的分析軟件和分子模擬軟件給研究人員提供了十分有價值的信息，解決了部分SELEX技術的問題。例如，通過計算機設計文庫，在SELEX開始之前就有目的地富集所需的特殊結構的序列，從根本上提高SELEX技術的效率，也在一定程度上解決了SELEX篩選出的核酸適配體結構簡單不具有高級結構的問題。

　　利用打分軟件有預見性地對次級文庫中序列進行評估，可以先篩選出一些具有高級結構和穩定結構的核酸適配體;再使用適配體結構預測軟件，對那些難以得到結構的適配體進行模擬，也一定程度上減輕了研究適配體結構的困難;最后可以在分子模擬平臺上進行對接驗證，由此在進行大量親和力實驗前，便可有方向性地得到一些“高親和力序列”，一定程度上降低了實驗室只合成低親和力的序列用于驗證最后導致篩選失敗的可能，也大大減少了SELEX篩選的輪數，提升了篩選的效率。

　　REFERENCES

　　[1]TuerkC,GoldL.Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment:RNAligandstobacteriophageT4DNApolymerase.Science,1990,249(4968):505-510.

　　[2]DjordjevicM.SELEXexperiments:newprospects,applicationsanddataanalysisininferringregulatorypathways.BiomolEng,2007,24(2):179-189.

　　[3]周成林,許化溪.SELEX技術及Aptamer在小分子中的應用進展.中國國境衛生檢疫雜志,2011,34(4):276-279,288.ZhouCL,XuHX.TheapplicationdevelopmentofSELEXandAptamerinmicromolecules.ChinJFrontHealQuar,2011,34(4):276-279,288(inChinese).

　　[4]RuigrokVJ,LevissonM,HekelaarJ,etal.Characterizationofaptamer-proteincomplexesbyX-raycrystallographyandalternativeapproaches.IntJMolSci,2012,13(8):10537-10552.

　　作者：鄧博文，高思懿，肖博懿，吳雨龍，孫豪，王梁華，孫銘娟

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