本文摘要：摘要：目的基于成分反映活性，活性指向功效的中藥質量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurumchinense等級評價的二分類Logistic模型，并開發出一種柴胡等級評價計算器。方法采用二分類Logistic算法將柴胡的柴胡皂苷a、d含量、環氧化酶2(COX2)生物效價、ABTS+清除率、DPPH
摘要：目的基于“成分反映活性，活性指向功效”的中藥質量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurumchinense等級評價的二分類Logistic模型，并開發出一種柴胡等級評價計算器。方法采用二分類Logistic算法將柴胡的柴胡皂苷a、d含量、環氧化酶2(COX2)生物效價、ABTS+清除率、DPPH∙清除率和羥自由基清除能力等指標進行關聯分析，建立用于柴胡的等級預測模型，并進行驗證。采用多元回歸分析方法、二分類Logistic回歸模型結合柴胡成分藥效相關數據，建立等級評價方程。采用JavaScript和CSS3技術，將等級評價方程嵌入HTML進行計算器插件的開發。結果Logistic預測模型概率公式初步將15個產地來源柴胡最終分為優、良、中、差4級，各批次所對應的預測歸屬等級明確，擬合概率P值均大于90%。開發了一種無需將數據傳給服務器端，通過動態地輸入測定的數據，可直接輸出柴胡等級評價結果的計算器。結論首次將柴胡功效成分相結合，建立評價柴胡質量等級的方法，可為柴胡質量評價提供重要依據;并開發出一種基于“藥效成分”相關聯的柴胡質量等級快速評價的計算器插件。
關鍵詞：柴胡;藥效論質;等級評價;中藥;質量控制;主成分分析;Logistic算法;計算器;柴胡皂苷;環氧化酶2;生物效價;ABTS+;DPPH∙;羥自由基;多元回歸分析
柴胡BupleuriRadix(BR)為傘形科柴胡屬植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]，按性狀不同，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡具有解熱、保肝、抗炎、抗腫瘤、免疫調節、抗抑郁等多種藥理活性[2]。藥用植物資源豐富、分布廣，臨床應用常以北柴胡為主，且長期以來在民間傳統醫學中用作消炎藥、解熱藥和鎮痛藥[3]。主要分布于我國東北、華北、西北、華東和華中各地。目前，柴胡質量控制主要參考《中國藥典》2020年版，以單一成分柴胡皂苷a、d含量作為主要質控指標。其混淆品小葉黑柴胡的柴胡皂苷a、d含量也符合《中國藥典》2020年版[4]。
因此，單一成分并不能全面地反映藥材內在質量，且中藥的化學物質實體與生命體分子網絡的交互作用具有模糊性、難以定量等特點[5]。故需要根據成分與藥效間多維度、多層次的相互作用對柴胡質量進行全方位評價。 目前，柴胡只有選貨和統貨的區別，隨著野生資源的減少，藥材市場上以栽培品為主，造成品種混亂，質量參差不齊，無明確區分柴胡質量等級的方法，若以柴胡皂苷a、d含量高低對市場上的柴胡進行分類可能具有一定的片面性，故將柴胡主要活性成分及藥效作為評價指標，其中柴胡皂苷a、d質量分數較高，具有良好的抗炎活性[68]。
已有研究表明[9]環氧化酶(cyclooxygenase，COX)是柴胡抗炎作用機制之一，它是花生四烯酸代謝和多種炎癥介質(前列腺素和血栓素A2)生物合成過程中重要的限速酶之一，具有2種亞型即COX1和COX2。COX1是機體固有的酶，在正常情況下存在于胃腸道、腎臟和血小板等組織細胞，不能被誘導增加，通過促進前列腺素及血栓烷A2的合成，發揮保護胃黏膜、維持腎血流量、調節血小板聚集、外周血管張力等內環境穩定的作用。
而大多數細胞中不出現COX2，可在生長因子、細胞因子、細胞毒素、致炎物質等刺激下表達，產生的底物前列腺素可引起炎癥、疼痛、發熱反應，這與柴胡傳統應用于抗炎解熱的作用相符合[10]。因此，通過測定對COX2的抑制作用，可用于評價柴胡抗炎活性。除此之外，柴胡在抗氧化方面具有較強的藥理作用[1112]。研究表明，氧化應激和炎癥被認為是各種疾病病理的核心機制，持續活躍的炎癥反應可導致活性氧的過度產生，誘導氧化應激，使細胞受到氧化損傷，同時產生炎癥。
因此，將氧化應激和炎癥與柴胡成分結合用于綜合評價柴胡質量，具有高度的代表性。故本研究對不同批次柴胡中的柴胡皂苷a、d含量及COX2的生物效價和抗氧化效果進行測定[13]，通過Logistic算法建立模型并進行驗證。本課題組前期對相關藥材等級評價[1415]積累了豐富經驗，建立了以“成分體外效價等級品質”網絡為反映體系的分級體制[1718]，可對不同產地來源的柴胡進行等級分類，為柴胡質量評價研究提供依據;并開發出一種柴胡質量等級快速評價的計算器插件，為拓寬中藥質量等級快速評價方法提供參考。
1儀器與試藥
1.1儀器Agilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;FW400AD型高速萬能粉碎機，天津鑫博得儀器有限公司;KQ300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;MultskanGo酶標儀，美國賽默飛世爾公司;SartoriusCPA225D十萬分之一電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司。
1.2材料對照品柴胡皂苷a(批號110777201912，質量分數≥98%)、柴胡皂苷d(批號110778201912，質量分數≥98%)，購自中國食品藥品檢定研究院;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)、羥自由基(OH·)測試試劑盒、DPPH自由基(DPPH·)清除能力試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;環氧化酶2(COX2)抑制劑篩選試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。柴胡主要收集于陜西省，經陜西中醫藥大學白吉慶副教授鑒定為傘形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根。
2方法與結果
2.1溶液的制備
2.1.1供試品溶液的制備[1]將藥材粉碎，過四號篩，精密稱定0.50g藥粉，加入含有5%濃氨水的甲醇溶液25mL，超聲30min，濾過，濾液用25mL甲醇洗滌藥渣2次，合并濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至5mL量瓶中，即得。
2.1.2對照品溶液的制備精密稱定柴胡皂苷a或d適量，加甲醇溶解，分別制成含1.03mg/mL柴胡皂苷a及1.08mg/mL柴胡皂苷d的溶液，即得。
2.2色譜條件色譜柱為Agilent5TCC18柱(250mm×4.6mm，5μm);流動相為水乙腈，梯度洗脫：0～50 min，25%～90%乙腈;50～55min，90%乙腈;55～57min，90%～25%乙腈;進樣體積10μL;體積流量1mL/min;柱溫30℃;檢測波長210nm。
2.3方法學考察
2.3.1線性關系考察
分別精密移取“2.1.2”項下柴胡皂苷a、d的對照品溶液，稀釋成2、4、8、16、32倍，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。以進樣量為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸分析。所得柴胡皂苷a回歸方程為Y=2702X+105.2，r=0.9999，表明線性關系良好，線性范圍0.032～1.030mg/mL;柴胡皂苷d回歸方程為Y=3020X+63.75，r=0.9998，表明線性關系良好，線性范圍0.033～1.080mg/mL。
2.3.2精密度考察
吸取“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續測定6次，結果顯示柴胡皂苷a、d峰面積RSD分別為0.22%、0.63%，表明該儀器精密度良好。
2.3.3穩定性考察
按“2.1.”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、16、24h時，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結果顯示間隔進樣所測得柴胡皂苷a、d峰面積的RSD分別為2.00%、2.94%，表明供試品溶液在24h內穩定性良好2.3.4重復性考察按“2.1.”項下方法制備份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示柴胡皂苷a、d峰面積的RSD分別為1.46%、2.31%，表明方法重復性良好。
2.3.5加樣回收率考察
取柴胡皂苷a、d含有量已知的同一批樣品(S2)約1g，稱取6份，精密稱定，分別加入與樣品中柴胡皂苷a、d含量相等的對照品，再按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率。測得柴胡皂苷a、d的平均加樣回收率分別為98.90%、100.17%，RSD分別為2.35%、2.27%，表明回收率良好。
2.4含量測定
各批次柴胡，按“2.1.1”項下制樣方法平行制備3份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，計算柴胡皂苷a、d的含量。各批次柴胡中柴胡皂苷a、d的含量。除S15批次柴胡外，其他所有批次柴胡皂苷a、d含量均符合《中國藥典》2020年版的規定。
2.5柴胡抑制COX2活性評價
2.5.1對照品溶液的制備
精密移取COX2試劑盒中塞來昔布適量，加COX2試劑盒中緩沖液溶解，用緩沖液將陽性對照品塞來昔布稀釋成6.25、12.5、25、50、100nmol/L的溶液作為對照品溶液。
3小結
3.1柴胡等級劃分與性狀指標的關系
柴胡作為臨床常用中藥材，具有較高的藥用價值，但目前記載的柴胡道地產區過多、沒有科學指導下培育的移栽品、次品與偽品充之都將造成柴胡藥材市場上品種混亂，導致質量參差不齊，在性狀上難以分辨真偽。傳統經驗鑒別方法是藥材鑒別的精髓，方法雖好，但需要專業型人才，而且藥材品種繁多，形態各異，尤其藥材經炮制加工后改變其形狀、性味，使藥材更加難以鑒別。
因此單純的依靠傳統經驗鑒定藥材真偽、確定優劣顯然是不夠可靠。故本實驗利用PCA對復雜信息中的多變量進行快速提取、重新組合、數學降維，生成新的綜合變量即主成分，經投影處理后，樣本最終落在主成分組成平面上的位置，即可表征不同樣本的總體信息。通過Logistic進行分析，尋找規律建立數學模型，進而綜合評價藥材質量。多變量大數據集無疑會為研究和應用提供豐富的信息，把現代科學和實踐經驗加以結合，一定能更好地判斷藥材的優劣，彌補傳統經驗之不足，保證臨床用藥安全有效。
3.2柴胡等級劃分與生物活性的關系
質量直接影響中醫臨床療效，故應以“因效而異”為原則對柴胡質量進行評價。但對于柴胡活性成分藥效差異的研究相對較少[2325]。目前，藥物主要成分與活性相結合的研究已成為評價藥物品質的方法之一，故本實驗將柴胡成分藥效相關聯。用于柴胡等級評價。
通過柴胡對COX2的生物效價研究結果顯示，各批次柴胡樣品間抗環氧化酶活性差異較大，柴胡質量濃度在3.125～25mg/mL對COX2抑制作用具有明顯的量效關系，建議增加柴胡抗環氧化酶活性作為柴胡質量的區別要點。Logistic模型回歸對所得預測模型準確性進行了考察，等級歸屬和各個等級間參數范圍明確，結果表明預測能力良好。本研究首次將柴胡中相關有效成分含量與體外效價相關聯，建立柴胡等級分類體系，具有一定應用價值。同時也存在一定局限性：樣本量少，柴胡樣本量僅限于柴胡道地產區陜西境內;為進一步完善柴胡等級研究，后續將擴大樣本來源。
3.3藥材等級計算器開發
本計算器基于JavaScript的web交互跨平臺技術，該應用需求也越來越多，JavaScript編輯的交互web頁面改變了傳統的www訪問模式，它把JAVA嵌入在HTML中，無需通用網關接口(commongatewayinterface，CGI)即可實現動態交互，既能滿足用戶對靈活性和方便性的要求，又能對用戶提出的要求進行快速響應。
因此，本計算器針對中藥等級評價和“成分功效”關聯計算困難的問題，設計了一種基于HTML5的用于中藥等級計算的可視化交互系統，能夠快速、高效地進行中藥等級計算并輸出簡明的評價結果。該計算器可獨立使用，也可作為網絡插件嵌入大型運算平臺使用。其特點是將多個中藥的生物活性數據和質控成分含量數據作為等級評價依據，采用多元回歸分析方法聯用Logistic回歸模型，通過大量數據擬合出特定藥材的等級評價方程。通過動態地輸入測定的數據，可直接經過后臺計算最終輸出藥材的等級評價結果，這樣既減少了參數選擇的嘗試過程，又為準確性提供了保證。
參考文獻
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作者：常百金1,2，唐志書1,2,3*，邱智東1*，劉妍如2，宋忠興2，賈艾玲1
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