牛至精油對常見致病菌的抗菌活性及作用機制研究進展

　　摘要：牛至精油是從牛至全草中提取得到的揮發性物質，含有香芹酚、百里香酚、丁香酚、D-檸檬烯、松油烯-4-醇等多種抗菌活性成分，通過作用于細胞壁、細胞膜、蛋白質、DNA、生物被膜等，在體內外起到有效抑殺金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、弧菌等養殖動物常見致病菌，廣泛應用于畜禽、水產動物養殖業中。文章對牛至精油的抗菌活性成分組成、體內外抗菌作用及抗菌作用機制進行綜述，以期為牛至精油作為飼料添加劑在養殖業中應用及抗菌劑研發方面提供參考。

　　關鍵詞：牛至精油;抗菌成分;抗菌活性;作用機制

　　在動物養殖的過程中，細菌、病毒、寄生蟲等感染性病害頻繁發生，但是抗生素的濫用，導致細菌耐藥性日益嚴重。因此，需要尋找高效、綠色、安全的新抗菌藥。牛至(OriganumvulgareL.)為唇形科牛至屬多年生的芳香草本植物，資源豐富，在我國常以其解表、理氣、化濕功效用于防治流感、中暑、嘔吐、腹痛、皮膚瘙癢及水腫等疾病[1]，而在歐美等國多以其抑菌、芳香功能作為食品儲存保鮮劑和食物烹飪調味劑[2]。

　　牛至精油是通過水蒸氣蒸餾法從牛至全草(包含葉、花、莖等)中提取得到的淡黃色或琥珀色透明液體，含有萜類、烷烴類、醇類、酸類、酯類、酚類、醛類等多種化學成分，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化、免疫調節等作用[3]。目前，牛至精油已應用于食品、醫藥、化工、動物生產等不同領域，且在養殖業中應用較為廣泛。據歐盟動物飼料添加劑和產品(FEEDAP)研究小組的調查評估結果顯示，牛至精油按建議添加使用，畜禽無不良反應[4];我國農業農村部也已批準牛至精油為飼料中藥添加劑。本文綜述牛至精油對養殖動物常見致病菌的抗菌成分組成、體內外抗菌活性及作用機制，以期為牛至油作為飼料添加劑在養殖業和抗菌劑的研發中提供參考。

　　1牛至精油的抗菌活性成分

　　通過氣相色譜法/質譜聯用儀(GC-MS)等測得水蒸氣蒸餾法所得牛至精油能夠穩定存在，且含量較高，具有抗菌作用的活性成分[5-7]，主要有香芹酚8.88%~80.0%、百里香酚0.30%~64.0%、丁香酚0.17%~2.04%等;α-蒎烯0.04%~10.78%、D-檸檬烯0.20%~6.91%、石竹烯3.70%~6.09%、β-石竹烯0.39%~7.77%、γ-松油烯0.03%~10.02%等;芳樟醇0.81%、α-松油醇0.32%~0.69%、4-松油醇14.90%等;對-聚傘花素5.36%~29.53%等。

　　許璐等[8]研究發現，牛至油中的主要成分香芹酚、百里香酚對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等養殖致病菌的抑菌圈直徑為20.2~58.3mm，最小抑菌濃度(MIC)均為0.313~1.250mL/L，最小殺菌濃度(MBC)為0.313~2.500mL/L，表現出顯著的抗菌作用。

　　其他成分如丁香酚對豬源肺炎克雷伯菌[9]、維氏氣單胞菌[10]、鰻弧菌的MIC分別為0.002、0.400、0.400g/L[11];D-檸檬烯對金黃色葡萄球菌、耐藥銅綠假單胞菌的MIC分別為0.256、0.512g/L[12];松油烯-4-醇對無乳鏈球菌[13]、MRSA[14]、大腸桿菌[15]的MIC分別為0.098g/L、0.16%、1.56mL/L;α-松油醇對大腸桿菌的MIC為0.78mL/L[15]，均表現出顯著的抗菌作用。

　　2牛至精油的體外抗菌作用

　　2.1單一牛至精油的抗菌作用

　　牛至精油對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、MRSA、乙型溶血性鏈球菌、糞腸球菌等)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、志賀氏菌、沙門氏菌、熒光假單胞菌等)及真菌(黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、念珠菌等)等養殖致病菌具有不同強度的抑殺作用。許璐等[8]測得牛至精油對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、葡萄牙念珠菌的抑菌圈直徑為17.5~52.3mm、MIC與MBC均為0.313~1.250mL/L。牛至精油對產腸毒大腸桿菌、出血性腸炎大腸桿菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌的MIC為0.04%~0.09%[16]，對黃曲霉菌、尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌的抑菌圈直徑為44.3~45.0mm、MIC為2.7~3.5μL/L[17]。因此，牛至精油具有抗菌譜廣、抗菌作用強。

　　2.2復合牛至精油的抗菌作用

　　牛至精油與其他精油的聯用，可發揮不同的抗菌效果，以分級抑菌濃度(FIC)為評價指標，FIC<0.5，協同;0.5~1.0，相加;1~4，無關;≥4，拮抗。吳克剛等[18]發現，牛至精油按1∶1聯用肉桂、馬郁蘭或百里香等精油可對大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、致瀉性大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌、黃曲霉起到相加抗菌作用(FIC聯為0.125~0.830)。Gutierrez等[19]研究發現，牛至精油按1∶1聯用羅勒、馬郁蘭、迷迭香、檸檬草等精油則僅對蠟樣芽孢桿菌有相加抗菌作用，而對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、李斯特菌則表現出無關作用。

　　2.3牛至精油聯合抗生素的抗菌作用

　　目前，畜禽、水產養殖致病菌的耐藥菌株日益增多，特別是革蘭陰性埃希氏菌已表現出交叉耐藥和多重耐藥。研究發現，牛至精油與沙拉沙星、氟苯尼考、多西環素能夠協同抗產ESBLs雞大腸桿菌(MIC聯為0.125mL/L、FIC聯為0.375)，與左氟沙星、乙酰甲喹、頭孢噻呋、頭孢曲松、黏菌素、林可霉素、阿莫西林起到相加作用(MIC聯為0.125~0.250mL/L、FIC聯為0.50~0.75)[20-21]。

　　3牛至精油在動物體內的抗菌作用

　　牛至精油是一種天然的高活性植物抑菌劑，在畜禽[22]及水產養殖[23]動物的不同生長階段應用，具有抗菌譜廣、驅蟲、促生長、毒副作用小、無殘留、無耐藥性、無三致危害等優點。

　　3.1牛至精油在豬體內的抑菌作用

　　豬病原性腹瀉病的致病原有病毒、細菌、寄生蟲、霉菌毒素和真菌性等，以細菌性腹瀉(大腸桿菌、C型產氣莢膜梭菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、奇異變形桿菌等)最為常見[24]。陳會良等[25]按150mg/kg添加10%牛至油預混劑至仔豬日糧中，連喂30d發現，空腸、盲腸、結腸的大腸桿菌數量顯著降低7.01%、6.04%、8.60%，說明牛至油能夠明顯改善腸道微生物菌群結構。

　　黃國清等[26]研究發現，使用300mg/kg牛至精油可有效降低仔豬腹瀉率(5.0%)，仔豬腹瀉率僅為金霉素組的50%、“金霉素+黃霉素”組的40%;仔豬死淘率(3.33%)僅為金霉素組和“金霉素+黃霉素”組的33.4%。張勇等[27]也發現，按1000mg/kg添加5%牛至油預混劑，可極顯著降低仔豬腹瀉率(4.08%)、糞中大腸桿菌數量。

　　3.2牛至精油在反芻家畜體內的抑菌作用

　　反芻家畜瘤胃及腸道中含有細菌、原生動物、古細菌和噬菌體等微生物多達7000余種[28]。牛、羊養殖過程中常見的細菌性致病原有肉毒梭菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、梭狀芽孢桿菌等[29]。陳昊等[30]發現，在荷斯坦奶牛全混合日糧(TMR)中按0.28g/頭添加牛至精油，連喂110d，可以有效降低奶牛的乳房炎發病率(2.0%)和腹瀉率(10.0%)，表明牛至油可以抑制奶牛體內病原微生物的繁殖。

　　楊昭等[31]按0.02%添加牛至精油至TMR中，通過平板菌落計數法、國標乳糖膽鹽發酵法檢測發現，TMR中霉菌、細菌、大腸菌群數均顯著減少。周瑞等[32]按日用量每頭7g/d添加牛至精油拌料，連喂82d后發現瘤胃、盲腸及直腸的物種豐度顯著提高，明顯抑制瘤胃中厚壁菌門、變形菌門、迷蹤菌門和綠彎菌門，同時有效降低瘤胃中原蟲數(11.88%)，改善瘤胃菌群結構。

　　3.3牛至精油在禽類體內的抑菌作用

　　細菌性疾病是雞養殖業的常見病和高發病，常見致病菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等[33]。Jia等[34]在蛋雞飼喂基礎日糧中添加100、200、400mg/kg的牛至精油，結果發現，不同添加量的牛至精油能夠顯著增加伯克霍爾德菌、放線菌、雙歧桿菌、腸球菌科和桿菌科的豐度，而回腸中志賀菌的豐度降低。黃國清等[35]在日糧中按75mg/kg添加10%牛至油預混劑，連喂35d，結果發現，牛至油可降低空腸和盲腸中大腸桿菌數量，提高乳酸桿菌、雙歧桿菌數量。除會良等[36]在日糧中按100mg/kg添加牛至精油連喂肉雞30d后發現，肉雞盲腸中大腸桿菌數量顯著下降，同時空腸中乳酸桿菌數量、盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌數量均顯著增加。

　　3.4牛至精油在魚類體內的抑菌作用

　　魚類養殖常見的細菌性疾病有腸炎病(腸型點狀氣單胞菌)、暴發性出血病(嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌)、赤皮病(熒光假單胞菌)、羅非魚潰爛病(嗜水氣單胞菌)、爛鰓病(柱狀屈撓桿菌)等[37]。Oliveira等[38]按0.5%添加牛至精油拌料連喂尼羅羅非魚4w后，以嗜水氣單胞菌攻毒魚體，15d后發現羅非魚存活率為53.37%，且存活魚腎臟未檢測出致病菌，表明牛至精油可在體內抑制有害菌的生長。曹升洪等[39]連續3w對羅非魚投喂添加150、300mg/kg牛至精油的餌料，在攻毒感染嗜水氣單胞菌72h內，魚體的白細胞、NBT陽性細胞數量及溶菌酶活性可恢復至正常水平，有效降低致病菌對魚體的感染損傷。在吉富羅非魚的餌料中添加150mg/kg牛至油，可使運動性氣單胞菌、假單胞菌病、鏈球菌感染發病率減少81.5%[40]。

　　3.5牛至精油在蝦類體內的抑菌作用

　　南美白對蝦常見的細菌性疾病有爛鰓病(弧菌、假單胞菌、氣單胞菌)、紅腿病(副溶血弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌、氣單胞菌、假單胞菌)、爛眼病(非01群霍亂弧菌)等[41]，其中弧菌感染性疾病最為常見、嚴重[42]。Gracia等[43]在基礎飼料中按5μL/kg添加不同有效成分組成的牛至精油(百里香酚∶香芹酚=48%∶23%、25%∶40%)，連喂4d，結果發現，牛至精油能夠顯著降低機體內的創傷弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌數量，有效抑制弧菌生長。當在南美白對蝦餌料中添加100mg/kg牛至精油，可使對蝦弧菌感染所致“紅腿病”發生率減少90.5%~93.6%[40]。

　　4牛至精油的抗菌作用機制

　　4.1牛至精油對細胞壁通透性的影響

　　細胞壁能夠有效保護菌體形態，控制細胞生長;同時也是化學信號(激素、生長調節劑等)、物理信號(電波、壓力等)傳遞的介質與通路，可進行物質運輸與信息傳遞介導細胞間相互作用侵入宿主。石超峰[15]通過透射電子顯微鏡下發現，α-松油醇在0.78mL/L濃度下可使大腸桿菌細胞形態變小，形狀不規則，結構層次混亂，細胞壁粗糙。吳克剛等[44]將大腸桿菌經過芳樟醇處理后，利用1-苯胺基-8-萘磺酸熒光探針可發現菌體表面疏水性增強，掃描/透射電子顯微鏡均觀察到微觀結構發生明顯變化(菌體外形萎縮)，結果均表明細胞壁完整性被破壞，使胞內物質泄漏、胞漿分布不均勻。

　　4.2牛至精油對細胞膜通透性的影響

　　細胞膜是包圍著細胞質的半滲透薄膜，為細胞生長提供穩定的內環境，也起到屏障保護、物質轉運、能量傳遞、生物功能等作用。Haiying等[45]研究發現，牛至精油可對MRSA細胞膜可造成不可逆的損傷，引起細胞內生物大分子物質的泄漏，抑制三羧酸循環途徑及其關鍵酶，影響代謝產物。Siroli等[46]測定不同濃度的牛至精油(30、40、50mg/L)、百里香酚(40、70、100mg/L)、香芹酚(20、35、50mg/L)作用于李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌后細胞膜脂肪酸組成和揮發性分子譜的變化，結果顯示，以上藥物均對生長過程中膜脂肪酸譜和產生的揮發性化合物有明顯的影響，誘導了細胞膜相關脂肪酸(C15∶0、C16∶0等)的顯著增加，特別是不飽和脂肪酸、反式異構體和特異性釋放的游離脂肪酸，表明牛至精油、百里香酚、香芹酚能夠影響或破壞受試菌株的細胞膜。

　　4.3牛至精油對蛋白質和DNA合成與代謝的影響

　　DNA是遺傳信息的載體，蛋白質的胞內生物合成是要在DNA指導下轉錄、翻譯而成，二者共同參與控制細菌細胞生命活動。程峰等[14]通過RNA-seq技術發現，被松油烯-4-醇處理后，MRSA有145個基因表達上調、159個基因表達下調，主要是支鏈氨基酸的生物合成與氮代謝、ABC轉運蛋白超家族等基因差異。石超峰等[47]通過核酸合成抑制試驗、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗研究α-松油醇對大腸桿菌的抑菌機理，結果顯示，α-松油醇可使大腸桿菌DNA熒光強度明顯減弱、可溶性蛋白譜帶變淺，表明其作用機制可能是抑制細菌核酸的合成和可溶性蛋白的表達。

　　4.4牛至精油對生物膜的影響

　　生物被膜是細菌的結構化群落，細菌粘附在被膜表面并嵌入細胞外聚合物質的自身基質中，對抗菌劑具有很高的抵抗力，因此，細菌為適應生存環境形成的生物被膜危害更大、抗性更強、抑制或消滅也更困難。Hacioglu等[48]研究顯示，牛至油能夠抑制白色念珠菌的生物膜黏附和形成，而且作用在成熟生物膜表面后可顯著減少其形成(抑制率50%)，同時也對不同濃度的白色念珠菌+金黃色葡萄球菌混合菌液的雙重生物膜有效，表明牛至精油對白色念珠菌起有效的抗生物膜作用。靳盼盼[49]分析發現，香芹酚和百里香酚均能抑制陰溝腸桿菌、糞腸球菌生物膜的形成，主要表現為細菌菌體變長、生物膜聚集過程變慢、厚度降低且膜內菌落總數減少、胞外多糖含量降低。

　　4.5牛至精油對群體感應的影響

　　群體感應是一種細胞間交流機制，能夠調控生物被膜、腐敗酶和毒力因子分泌等。細菌利用群體感應來調節某些表型表達，進而協調機體行為。王雅瑩[50]通過轉錄組學分析發現，香芹酚能夠影響與熒光假單胞菌多種生物被膜相關的基因，包括上調多糖代謝、pst系統和PhoB/U雙組分系統相關的基因，從而干擾生物被膜的形成，并顯著下調菌體鞭毛合成、趨向性蛋白、氨基酸脫羧酶和蛋白酶等與運動和致腐的基因以及編碼群體感應LuxR受體蛋白的基因。

　　香芹酚能夠作用于靶蛋白LuxR，干擾群體感應通路及其調控的生物被膜和致腐能力。香芹酚[51]、百里香酚[52]可以通過抑制銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌中LasI的活性，降低群體感應基因(如lasR、LuxS、pfs等)、生物膜和群集運動的表達，干擾細菌的群體感應通路，破壞生物膜使得菌體死亡。

　　5展望

　　雖然牛至精油對細菌感染性病害的防治效果顯著，但還存在一些問題：

　　(1)有效抗菌活性成分復雜多樣，但多聚焦高含量成分分析而忽略微量成分，成分-成分間相關性研究甚少，綜合起效成分組成不明確;同時成分種類及含量易受品種、產地等的影響而動態變化，缺乏有效可控的質量標準。

　　(2)目前研究多為單一精油或成分的體外抗菌活性，與不同揮發油、抗生素的聯用研究甚少，綜合抗菌或聯合抗菌的作用機制和作用靶點尚未明確;并且僅針對單一菌株進行特定環境的靜態反應進行研究，缺乏不同條件、多種菌株的交叉動態考察，未能真實模擬實際養殖環境。

　　(3)牛至油雖然在不同品種動物養殖中應用，但缺乏系統的體內外抗菌相關性研究，尚無有效抗菌成分在體內吸收、分布、代謝、排泄等過程的變化分析，無法真正指導養殖用藥。因此，牛至精油的整體作用仍待深入研究，且需要建立體內外抗菌作用的相關性，才能有效應用和指導日常養殖。

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　　作者：許巧欣1，2柯怡欣3陳詠琪1張萱萱1蔡延渠1*李鐘2*

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