本文摘要：摘要本研究利用二代測序技術IlluminaHiseq平臺對飛蓬屬(Erigeron)藥用植物燈盞花(ErigeronBreviscapus)及其近緣種多舌飛蓬(Erigeronmultiradiatus)進行了葉綠體全基因組測序，通過生物信息學分析方法進行序列組裝、注釋和基本結構分析，并將其與19個已發表的植物葉綠體
摘要本研究利用二代測序技術IlluminaHiseq平臺對飛蓬屬(Erigeron)藥用植物燈盞花(ErigeronBreviscapus)及其近緣種多舌飛蓬(Erigeronmultiradiatus)進行了葉綠體全基因組測序，通過生物信息學分析方法進行序列組裝、注釋和基本結構分析，并將其與19個已發表的植物葉綠體全基因組進行了系統發育分析。結果顯示，葉綠體全基因組長度范圍為152175~152372bp，大單拷貝區的范圍為84684~84881bp，小單拷貝區的范圍為18102~18133bp，兩個反向重復區的范圍為24667~24699bp。葉綠體全基因組中的GC含量范圍為37.1%~37.2%，共注釋到129個基因，其中蛋白編碼基因(PCGs)84個，tRNA基因37個，rRNA基因8個。在飛蓬屬葉綠體基因組中共檢測到簡單重復序列88~92個，長重復序列47~49個;此外，在變異熱點區域篩選到9個高變片段。系統發育結果顯示，多舌飛蓬與燈盞花以100%的支持率聚為一支，互為姊妹群。本研究結果將為燈盞花保護遺傳學和資源開發利用等研究提供理論基礎。
關鍵詞燈盞花;多舌飛蓬;葉綠體基因組;SSR;系統發育
燈盞花(Erigeronbreviscapus(Vant.)HandMazz.)又名燈盞細辛和短葶飛蓬，為菊科(Compositae)飛蓬屬(Erigeron)多年生草本植物，主要分布于中國云南、四川等西部和西南部海拔1200~3500m的中山和高山開闊山坡草地、林緣或疏林下(中國植物志編輯委員會,1985,科學出版社,pp.308)。燈盞花藥材味辛、微苦，性溫，歸心、肝經。具有散寒解表、祛風除濕、舒筋活血、消積止痛等功效(中國藥典委員會,2020,中國醫藥科技出版社,pp.154)。
現臨床上主要用于心腦血管疾病及其后遺癥、癱瘓等治療。燈盞花作為治療心血管病的原料藥，是云南的道地藥材之一。燈盞花成片分布的地區很少，隨著人們對燈盞花藥材需求量的不斷增加以及對野生資源量的過度采集，野生資源蘊藏量已不能滿足人類需求和企業生產的需要。
燈盞花種子細小、世代周期短，品種極易退化，而且其嚴格的自交不親和性也容易引起品種的混雜退化，因此，需要不斷篩選優良野生種源，培育成分專用型新品種，擴大新藥源以滿足藥材生產的需求(李銳等,2019)。多舌飛蓬(Erigeronmultiradiatus(Wall.)Benth.)與燈盞花為同屬植物，分布于中國四川和云南等地，常生長于海拔2500~4600m亞高山和高山草地、山坡和林緣;資源豐富，在藏醫藥中以全草入藥。
一般來說，植物物種之間的親緣關系越近，所含的化學成分也越相近。因此，利用植物類群之間的親緣關系，就能較快地發現新藥源和替代品。已有報道對燈盞花及其近緣種多舌飛蓬進行質量評價，得出多舌飛蓬質量尚可，有替代燈盞花藥材的可能(肖琳婧等,2019)。 葉綠體是植物中重要的細胞器，在光合作用和碳固定中起著關鍵作用，現在普遍認為葉綠體起源于內共生藍藻，具有自主遺傳基因組(Dyalletal.,2004)。研究表明，大部分被子植物的葉綠體基因組具有典型的環狀四分體結構(張明英等,2020)。
包括：1個大單拷貝區(largesinglecopyregion,LSC)、1個小單拷貝區(smallsinglecopyregion,SSC)以及2個反向重復區(invertedrepeatregions,IRa/IRb)，大小一般在120~220kb，大約包括130個基因，主要包括3類：與基因表達相關的基因，與光合作用相關的基因和RNA基因(Yangetal.,2017)。與核基因組和線粒體基因組相比，葉綠體基因組具有結構保守、單親遺傳不存在重組、序列變異度適中等特點，是分子生物學研究中的重要工具(Jansenetal.,2007)。
自從1986年葉綠體全基因組在煙草(Shinozakietal.,1986)、地錢(Ohyamaetal.,1986)中首次公布以來，現在已經超過3300條葉綠體基因組被GenBank收錄(姜汶君等,2020)。葉綠體全基因組序列的測定不僅加速了物種在進化、遷徙方面的研究，還對物種的鑒定、分子標記、系統發育等研究起著巨大的推進作用(武立偉等,2020)。
本研究基于二代高通量測序技術和生物信息學分析方法，對不同居群燈盞花及其近緣種多舌飛蓬進行葉綠體全基因組測序、組裝、注釋，并且對其序列變異和結構特征進行解析，并選擇了17個已發表的菊科植物，2個與菊科親緣關系較近的桔梗科植物(外類群)葉綠體全基因組進行了系統發育分析。旨在為燈盞花的資源開發利用、飛蓬屬植物種間系統發育關系、物種鑒定以及尋找新藥源等研究奠定了基礎。
1結果與分析
1.1燈盞花、多舌飛蓬葉綠體全基因組基本特征及分類燈盞花、多舌飛蓬具有與大多數被子植物葉綠體基因相似的環狀四分體結構。不同居群燈盞花的葉綠體全基因組長度范圍為152175~152372bp，多舌飛蓬葉綠體全基因組長度為152281bp，GC含量范圍為37.1%~37.2%;燈盞花大單拷貝區(LSC)長度為84684~84881bp，小單拷貝區(SSC)長度為18102~18133bp，兩個反向重復區(IRa/IRb)范圍為24667~24699bp;多舌飛蓬的LSC長度為84789bp，SSC長度為18110bp，IR區長度為24691bp。所有居群葉綠體基因組均注釋到129個基因，其中蛋白編碼基因(PCGs)84個，tRNA基因37個，rRNA基因8個。
燈盞花與多舌飛蓬基因分類情況，根據其功能可以將它們分為3類：第一類是與光合作用系統有關的基因，包括光系統I基因(5個)、光系統Ⅱ基因(15個)、NADPH氧化還原酶基因(11個)、二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因(1個)、ATP酶基因和細胞色素b/f復合體基因各6個;第二類是與轉錄、翻譯有關的基因，包括核糖體RNA基因(4個)、轉運RNA(tRNA)基因(30個)、RNA聚合酶亞基基因(4個)、核糖體蛋白基因(21個)和翻譯起始密碼子基因(1個)等;第三類是與其他生物合成相關的基因，如matK、ccsA等。
在這些基因中含有17個雙拷貝基因，包括1個ATP酶基因(atpF)、2個細胞色素b/f復合體基因(petB,petD)、2個NADPH氧化還原酶基因(ndhA,ndhB)、1個RNA聚合酶亞基基因(rpoC1)、核糖體蛋白大/小亞基基因各2個(rpl2,rpl16,rps12,rps16)、6個轉運RNA基因(trnAUGC,trnGUCC,trnIGAU,trnKUUU,trnLUAA,trnVUAC)、未知功能基因1個(ycf3)。
1.2長重復序列及SSR分析
本研究利用在線微衛星識別軟件MISA，在燈盞花和多舌飛蓬葉綠體基因組中共檢測到簡單重復序列(simplezsequencerepeat,SSR)88~92個。其中單核苷酸重復(Mononucleotides)32~36個(34.78%~40.45%)，二核苷酸重復(Dinucleotides)19~23個(20.88%~25.00%)，三核苷酸重復(Trinucleotides)14~15個(15.91%~16.85%)，四核苷酸重復(Tetranucleotides)13~16個(14.61%~18.18%)，五核苷酸重復(Pentanucleotide)4~6個(4.35%~6.74%)，六核苷酸重復(Hexanucleotide)除居群ML、SM、XW檢測到1個外(1.09%~1.12%)，其余居群未檢測到。
除SSRs外，長度≥30bp的重復被認為是長重復序列。對本研究的6個居群進行長重復序列檢測，除SM居群檢測到47個長重復序列外，其他居群均檢測到49個長重復。多舌飛蓬總的49個長重復，包括23個回文重復、19個正向重復、6個反向重復、1個互補重復;燈盞花的回文重復為22~23個，正向重復17~19個，反向重復4~8個，互補重復1~3個。這些重復序列中大部分序列在基因間隔區，長度在30~42bp之間。
2討論
燈盞花是云南重點開發的“五大天然系列”藥物之一，由于其在心腦血管系統疾病上具有較高的藥用價值，在醫藥生產方面需求較大。目前，燈盞花人工種植現已初具規模，為了保證其原材料的品質和穩定性，已有報道通過RADP(周利杰等,2005;楊生超等,2008)、DALP(劉潔,2006)、ISSR(楊生超等,2010)、燈盞花DNA指紋圖譜(熊勇等,2012)、AFLP(張薇等,2013)等分子手段為燈盞花育種提供了理論依據和育種素材。
本研究基于葉綠體全基因組及系統發育分析的角度，對上述研究進行補充。基于二代高通量測序技術和生物信息學分析方法對燈盞花及其近緣種多舌飛蓬葉綠體全基因組進行了分析研究。結果顯示，燈盞花、多舌飛蓬均具有被子植物葉綠體基因組典型的四分體結構，所編碼的基因數量、類別和排列順序高度一致，基因組序列總長152175~152372bp，葉綠體基因組總共編碼129個基因，其中蛋白編碼基因(PCGs)84個，tRNA基因37個，rRNA基因8個。
葉綠體全基因組中的GC含量范圍為37.1%~37.2%，這與大多數被子植物葉綠體基因組具有31.0%~38.0%的GC含量相似，如橢圓葉花錨(王虹雨等,2021,私人通信)、花園君子蘭(吳海紅等,2021,私人通信)、平托花生(張小利等,2021,私人通信)等。在SSC、LSC和IR區的GC含量表現出明顯的差別，分別為31.0%、35.0%~35.1%、43.1%~43.2%。IR區的GC含量較高可能是由于該區域的rRNA基因具有高水平的GC值，而SSC區的低GC含量可能與位于該區域的NADH相關(Zhengetal.,2006)。
葉綠體基因組中的SSRs因含量豐富、多態性高，且為母系遺傳等優點而被作為分子標記廣泛用于物種群體遺傳學(Jayaswalletal.,2021)、譜系地理學(Chmielewskietal.,2015)等研究。本研究通過在線軟件分析共得到燈盞花、多舌飛蓬簡單重復88~92個，長重復47~49個，這些重復序列可以為燈盞花、多舌飛蓬的遺傳多樣性及保護遺傳學等相關研究提供候選分子標記。
IR區邊界的擴張和收縮被認為是被子植物葉綠體基因組大小變化的主要原因。本研究通過對燈盞花與多舌飛蓬葉綠體基因組IR/SC邊界分析發現，燈盞花與其近緣種多舌飛蓬葉綠體基因組IRs區大小和基因組成高度保守。被子植物葉綠體基因組序列中的一些高變異區由于其序列短，能作為DNA條形碼經濟、快速的區分不同屬的植物，往往可以作為物種鑒定及系統發育關系分析等相關研究的分子標記(Lietal.,2019)。
基于mVISTA和DNAsp軟件分析結果顯示，在7個非編碼區(rps2atpI,trnTpsbD,trnTtrnL,ndhCatpE,ndhFtrnL,trnTUGUtrnLUAA,ccsAndhD)和2個編碼區(ycf3,ndhD)存在明顯變異。這些區域可能在物種水平上進行更快速地核苷酸取代，了解和掌握這些變異熱點，不僅有利于理解飛蓬屬葉綠體基因組進化特點，而且基于這些序列片段設計分子標記，可為燈盞花分子鑒定的DNA條形碼篩選提供參考。 本研究利用從NCBI下載的17條菊科、2條桔梗科植物(外類群)的葉綠體基因組序列以及本試驗測得的5個燈盞花和1個多舌飛蓬葉綠體基因組序列構建ML系統進化樹，以探討燈盞花和多舌飛蓬的系統進化位置關系。結果以100%的支持率把多舌飛蓬與燈盞花聚為一支，互為姊妹群。
綜上所述，燈盞花與多舌飛蓬葉綠體基因組結構特征相似，序列差異較小。因此，本研究從葉綠體基因組角度認為多舌飛蓬可作為燈盞花的替代品。此研究結果進一步支持了肖琳婧等(2019)對燈盞花及其近緣種質量評價研究得出的結論。本研究對燈盞花及其近緣種多舌飛蓬葉綠體全基因組測序及系統發育分析不僅豐富了菊科植物葉綠體基因組序列的數量，同時為飛蓬屬物種鑒定、系統發育、篩選優良種質及選取替代藥材、實現該藥用植物的可持續利用提供理論基礎。
3材料與方法
3.1試驗材料
采集飛蓬屬內的兩個種，其中燈盞花(Ebreviscapus)5個野生居群，多舌飛蓬(E.multiradiatus)1個野生居群。樣品由云南中醫藥大學李國棟副教授鑒定。采集到的新鮮幼嫩葉片放入硅膠中快速脫水干燥，用于基因組DNA提取。憑證標本存放于云南中醫藥大學中藥材優良種苗繁育工程研究中心。
3.2基因組
DNA提取與測序取新鮮幼嫩葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke公司,北京)提取總DNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和NanodropOne超微量分光光度計檢測DNA質量及濃度。將檢測合格的DNA送至上海美吉生物醫藥科技有限公司采用IlluminaHiSeq2500PE150平臺進行建庫測序。
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作者：田星1李中霽1劉小莉2*李國棟1*
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