河西走廊荒漠土壤微生物群落結構及環境響應

　　摘要：荒漠土壤中微生物生存適應機制及其生態系統功能對揭示干旱區物質轉化過程具有重要意義。沿河西走廊東南至西北自然降水遞減梯度下設置16個樣帶，采用高通量測序技術探究土壤細菌和真菌群落多樣性特征，揭示微生物多樣性、優勢菌群與土壤機械組成、養分關系。結果顯示：河西走廊荒漠土壤細菌中厚壁菌門Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)為優勢群落，部分樣帶厚壁菌門相對豐度最高達85;真菌中子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)為優勢群落，其相對豐度均大于>5%。相關性分析顯示：粗粉粒(0.05~0.02mm)、細粉粒(0.25~0.10mm)、黏粒(<0.002mm)、有效磷(AP)和解堿氮(AN)對細菌多樣性影響極顯著，細粉粒(0.25~0.10mm)、黏粒(<0.002mm)、有效磷(AP)和解堿氮(AN)對真菌多樣性影響極顯著(P<0.01)。冗余分析顯示：細粉粒(0.25~0.10mm)、有效磷(AP)和有機碳(SOC)對細菌群落影響顯著，黏粒(<0.002mm)和有效磷(AP)對真菌群落影響顯著(<0.05)。研究表明了河西走廊荒漠土壤微生物群落結構的組成、變化及影響因子，解釋了土壤環境對微生物分布的影響及微生物對土壤生態系統系統發展的作用，為保護生物多樣性及荒漠生態服務提供理論參考。

　　關鍵詞：河西走廊;荒漠土壤微生物;微生物群落結構;土壤理化;冗余分析

　　地球上荒漠化土壤主要分布于熱帶、亞熱帶和溫帶干旱區，占陸地總面積約1.6×10km。荒漠土壤營養匱乏、鹽堿化程度嚴重、植被覆蓋率很低、氣候變化多樣、生物量和生物多樣性較低，曾被認為不適于生命生存和活動[1。然而，在此惡劣環境條件下，荒漠土壤卻蘊含著豐富的微生物資源。土壤微生物是地下的主要生物成份，是土壤系統中最活躍的部分，在促進物質分解、養分轉化、能量流動和生物地球化學循環方面發揮著重要作用，影響著植物生長發育和生態系統演變。

　　在這些過程中，土壤微生物作為紐帶聯系著植物和土壤之間的相互作用。研究發現，荒漠植被的適應性在很大程度上依賴于土壤微生物的響應。土壤微生物控制著土壤生態系統的許多過程，對土壤生態系統功能的穩定和可持續具有重大意義。由于荒漠生態系統環境特殊，使得對荒漠土壤微生物的研究起步較晚，直到1948年在美國首次開展了對荒漠土壤結皮層微生物的研究。

　　隨著測序技術的進步，對荒漠土壤微生物的研究越來越廣泛，研究區域主要集中在中國西北部、美洲西海岸、非洲北部沿海以及南極地區，研究熱點主要為微生物群落結構分布特征及其影響因素，眾多研究表明，放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門是荒漠土壤中的主要細菌類群，且隨著所處地理環境不同菌群豐度不同[1。varroGonzalez對Atacam沙漠微生物多樣性的研究發現水量差異對微生物豐度影響較大，Atacama沙漠土壤微生物數量隨著從海洋移向內陸濕潤的水汽減少而明顯減少，到了極干旱的Yungay地區微生物數量基本為零[1。

　　土壤理化性質作為微生物生存環境左右其分布及生態功能，有機碳與可培養好氧細菌數量有明顯關系，好氧菌數量隨著有機碳含量增高而增高，而荒漠缺少植被和降水，固氮過程主要由固氮微生物完成，所以荒漠環境中固氮微生物數量明顯較高，并且荒漠土壤pH會影響微生物的硝化和反硝化過程，從而改變固氮微生物數量[1。荒漠土壤微生物分布直接取決于環境因子，因此在進行土壤微生物研究時，微生物與環境的相互作用已成為至關重要的一部分。位于中國西北部的河西走廊是甘肅省主要的農業區，因地理位置和環境特殊，是西北乃至全國重要的生態屏障和經濟地帶[1。

　　如今由于水資源利用過度等因素，土壤荒漠化日趨嚴重，嚴重制約了人類的生存和發展。對荒漠地區微生物群落結構及多樣性的研究，有利于揭示荒漠生態系統的功能，提高對環境與微生物之間相互作用的認識，為維持生態系統穩定性及保護物種多樣性提供理論依據。本研究在河西走廊荒漠土壤區進行土壤樣品采集，探究微生物的群落結構和多樣性分布格局及群落結構與環境因子的相互關系，明確土壤環境對微生物存在的影響及微生物對土壤生態系統發展的作用，為保護生物多樣性及荒漠生態環境提供理論參考。

　　1材料與方法

　　1.1研究區概況

　　甘肅河西走廊(37°15′—41°30′N，92°21′—104°45′E)位于甘肅省西北部，東段起于烏鞘嶺山脈，西段結束于古玉門關，總面積為27.6×10km。南北距離為40100km，東西距離約為120km14。河西走廊氣候受大陸性氣候和青藏高原氣候影響，氣候條件夏季干燥冬季寒冷，年平均氣溫約為10℃，年降水量為30320mm，年蒸發量為500200mm，全年日照時數800~30015，河西走廊的低降水量和高強度的蒸發量造成了中國乃至世界上的最大沙漠侵蝕區——西北荒漠帶16。

　　1.2試驗設計與樣品采集

　　于2018年月沿河西走廊東南至西北方向自然降水遞減梯度下設置16個自然狀態下，無人為干擾和土地利用的荒漠土壤樣帶(HX1~HX16)。每個樣帶內隨機布設個10×10樣地(個重復)，相鄰樣地之間保持一定距離(不小于10)，在所選取的每個樣地內去除地表枯落物，剝離表土后用土壤取樣器隨機采集20cm的土樣個，剔除植物根系和殘體，保存于滅菌的密封袋中并儲存于液氮罐帶回實驗室。用于分析微生物多樣性的土壤放于20℃冰箱保存;其他土壤根據測定指標的不同要求，對其養分含量、機械組成進行分析。

　　1.3土壤理化性質測定

　　土壤機械組成(指土壤粒徑分級)采用英國Malver公司生產的Mastersizer2000型激光粒度儀測定，土壤粒徑主要分為石礫(Gravel)>2mm、砂粒(Sand，細分為五個等級：極粗砂粒，2~1mm;粗砂粒，1~0.5mm;中等砂粒，0.5~0.25mm;細砂粒，0.25~0.10mm;極細砂粒，0.10~0.05mm)、粉粒(Silt，分兩個等級：粗粉粒0.050.02mm、細粉粒0.020.002mm)和黏粒(Clay)<0.002mm。由于研究區石礫體積過大不宜用儀器進行測量，采用稱重求比例的方法得到石礫含量。

　　土壤理化性質測定：有機碳(SOC)采用重鉻酸鉀氧化外加熱法，堿解氮(AN)采用堿解擴散法，全氮(TN)采用凱氏定氮法，全磷(TP)采用NaOH熔融后鉬銻抗比色法，有效磷(AP)采用0.5mol·LNaHC浸提后鉬銻抗比色法，全鉀(TK)采用NaOH熔融后火焰光度法，速效鉀(AK)用mol·LNHOAc浸提后火焰光度法，土壤含水量(SW)采用烘干法，pH和電導率用上海精密科學儀器有限公司生產的PHS3D型pH計測定17。

　　土壤總DNA的提取及16SrRNA基因的PCR擴增使用MoBio土壤微生物DNA強力提取試劑盒(PowerSoil®DNAIsolationKit，MOBIOLaboratories)對土壤總DNA進行提取，提取的細菌和真菌基因組進行16SrDNAV4+V5區和ITS1區PCR擴增(細菌引物為：F5'GTGYCAGCMGCCGCGGTAA3';R5'CCGYCAATTYMTTTRAGTT;真菌引物為：F5'CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3';R5'GCTGCGTTCTTCATCGATGC3')，擴增后的PCR產物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳純化。PCR20μL體系：模板DNA(10ng)，0.8μLμ一對引物，0.4μLPfu聚合酶，μLPCRBuffer，μL2.5mol·dNTP，ddH補至總體系20μL。PCR擴增程序：在95℃下預變性min，然后在95℃下循環30，在55℃退火30，72℃延伸min，然后再在72℃下延伸10min。最后將純化產物進行IlluminaHiseq2500上機測序。

　　1.4數據處理與分析

　　16SrDNA通過軟件FLASH進行PEreads拼接得到RawTags，然后通過質量過濾RawTags得到CleanTags18，使用USEARCH軟件檢查并丟棄了嵌合體序列得到EffectiveTags19。在相似性97%的水平上，以0.005%作為閾值，使用軟件QIIME進行OTU聚類[2。

　　基于已分類的TU使用Mothur進行細菌和真菌α多樣性(Ace指數、Chao1指數、Simpson指數、Shannon指數)分析[2，使用vegan包進行不同樣帶OTU豐度數據的主坐標分析(Principalcoordinateanalysis，PC)，并用SPSS25.0進行單因素方差分析及Pearson相關性分析。利用語言工具繪制門分類學水平下的群落結構圖，使用Canoco5.0軟件將優勢菌門與土壤機械組成和化學因子進行冗余分析(RedundancyAnalysisRDA)，以說明土壤微生物群落結構、環境因子和樣帶之間的關系，并用蒙特卡羅檢驗(montecarlotest)約束軸的顯著性(用值作為統計量)。

　　2結果

　　2.1河西走廊荒漠土壤微生物群落結構

　　對測序所得的稀釋曲線進行分析，結果表明測序覆蓋度高，可用于后續分析。在Silva(細菌)和Unite(真菌)分類學數據庫中對OTU進行分類學注釋后，得到微生物群落結構組成。由統計結果可知，相對豐度大于1%的細菌群落有：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)和藍細菌門(Cyanobacteria)。數據分析結果可知，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門為優勢菌門(相對豐度>5%)。

　　在“屬”水平進行分析，HX5~HX10的個樣本中均發現較高含量的芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和紅球菌屬(Rhodococcus)，此外還發現了不動細胞菌屬(Acinetobacter)、鏈霉菌屬(Streptococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、藍細菌屬(Halobacteriaceae)和酸微菌屬(idobacterium)，但分布不均勻，僅在部分樣本中發現。從結構來看，表現為16個樣本共有大多數相同的細菌群落，但不同樣帶優勢菌門存在一定差異。河西走廊荒漠土壤相對豐度大于1%的真菌群落有：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)。

　　數據分析結果表明：子囊菌門和擔子菌門為優勢菌門(相對豐度>5%)。荒漠土壤主要菌屬為毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉菌屬(Asperyillus)，在每個樣本中均有分布但分布不均勻。并且在各樣帶都檢測到未分類和未識別的真菌，尤其在HX6中未分類的真菌65.28%，在HX13中未識別的真菌占30.74%。

　　2.2河西走廊荒漠土壤微生物群落α和β多樣性特征

　　使用高通量測序技術在16個樣帶得到不同數量的優質細菌和真菌序列，聚類分析表明，各樣帶土壤細菌和真菌群落豐富度和多樣性存在差異。河西走廊X4樣帶OTU數量、Chao1指數和Shannon指數最高，impson指數最低，說明X4樣帶細菌群落豐富度和多樣性最高，而X9和X10樣帶土壤OTU數量和Chao1指數最低，說明其群落豐富度最低，兩地的Simpson指數和Shannon指數表明其群落多樣性較低，且單因素方差分析結果顯示不同樣帶細菌群落多樣性差異顯著(P<0.05)。真菌α多樣性指數顯示：X5~HX10樣帶TU數量和Chao1指數顯著其他樣帶(P<0.05)，說明X5~HX10樣帶真菌群落豐富度較低，X8~HX10樣帶Simpson指數和Shannon指數表明其真菌群落多樣性較低。

　　2.3河西走廊荒漠土壤微生物群落結構與理化因子相關性

　　微生物群落結構受環境影響顯著，RDA分析結果可以反映群落結構與環境因子之間的關系，從而可知影響微生物分布的重要環境驅動因子。細菌群落與機械組成RDA分析結果表明：荒漠土壤細菌群落結構與細粉粒顯著相關(值為6.5，P<0.05，蒙特卡羅算法)。

　　從物種的分布來看，優勢菌群厚壁菌門與黏粒正相關，與其余土壤粒徑負相關;變形菌門和放線菌門與黏粒成負相關。真菌群落與機械組成RDA分析結果表明：真菌群落結構與黏粒顯著相關(值為5.2，<0.05，蒙特卡羅算法)，優勢菌群子囊菌門和擔子菌門與黏粒負相關。

　　3討論

　　土壤為微生物群落生長繁殖提供微環境，其理化性質又間接影響土壤微生物群落結構的組成22。本研究對河西走廊荒漠土壤理化性質進行測定分析，結果表明：河西走廊荒漠土壤鹽堿化嚴重，土壤養分含量處于較低或極低水平，鹽堿和營養匱乏的土壤環境可能對微生物群落組成產生一定影響。

　　為探究微生物群落組成與土壤環境間的影響機制，本研究采用高通量測序技術檢測了16個樣帶的土壤樣品，結果顯示，河西走廊荒漠土壤細菌群落以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門為主，與前人對荒漠土壤細菌群落的研究結果相同[2。荒漠地區持續的干旱和高強度的太陽輻射，促成了鹽堿化嚴重、有機物含量少，植被缺乏的環境。而放線菌、厚壁菌等具備孢子生殖、多個UV修復機制、競爭優勢的次級代謝合成能力24，并且其部分菌屬如：芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬具有良好的嗜鹽嗜堿特性，因此成為惡劣環境強有力的生存者，可以在此鹽堿干旱環境中定殖。

　　并且本研究發現河西走廊荒漠土壤中厚壁菌門豐度高達5%，An等25對塔克拉瑪干沙漠微生物多樣性的研究發現中國西部戈壁沙漠土壤厚壁菌門的相對豐度高達80%，得到相同研究結果。厚壁菌門自身的適應性除外，環境因素對其分布有很大程度的影響，一方面厚壁菌門豐度與土壤pH正相關，河西走廊荒漠土壤pH呈堿性或者強堿性，有利于厚壁菌門的生存;另一方面研究區有效磷含量高，厚壁菌門豐度與有效磷含量呈顯著正相關，并且磷元素是組成細菌細胞壁的主要成分，厚壁菌細胞壁厚度達50nm，較高含量的有效磷同樣有利于厚壁菌門的生存。

　　荒漠環境惡劣，高溫、干旱和紫外輻射減弱了整個荒漠生態系統的碳、氮循環過程[1，在荒漠環境中，土壤氮循環主要以異化硝酸鹽還原途徑、反硝化途徑和硝化途徑為主，變形菌門、厚壁菌門、廣古菌門、放線菌門、擬桿菌門參與其中，為氮循環的主要貢獻者;CO固定途徑主要以C4雙羧酸循環、卡爾文循環、還原性三羧酸循環為主，變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門為CO固定途徑主要參與者24。固碳、固氮微生物的存在增強了荒漠環境的碳氮循環能力，加快荒漠區物質轉化并且為植物生長提供更多的化學元素，從而提高荒漠土壤生態系統的穩定性26。

　　真菌良好的抗壓性使其在荒漠土壤中廣泛分布，孫薔27對內蒙古和青海省荒漠土壤真菌群落結構和多樣性的研究發現荒漠土壤真菌優勢物種為子囊菌門和擔子菌門，在大興安嶺林地、納帕海高原濕地和內蒙古草原生態系統的研究均發現優勢菌門為子囊菌門和擔子菌門28，說明子囊菌門和擔子菌門能在多種類型土壤中且作為優勢門存在，它們大多為腐生菌，能夠分解動植物殘體，釋放生物可利用的營養元素，從而促進土壤養分循環，提高土壤質量，增強荒漠植物的定殖、生長發育。在Colorado高原分離出屬于子囊菌門的鏈格孢屬可以產生菌絲和色素應對干旱和輻射環境，在內蒙古荒漠草原和Negev荒漠分離出的真菌以曲霉菌屬為主29，這些可以釋放土壤中的營養元素供植物吸收的菌屬在本研究中同樣存在。

　　雖然荒漠中的真菌豐度不及細菌，但在荒漠土壤質量改善和促進植物生長方面起著重要的作用，并且在本研究中發現較多尚未分類和未識別的菌門，說明河西走廊土壤真菌群落信息還有很大的挖掘潛力。土壤理化性質在很大程度上影響微生物群落結構和多樣性特征，在全球氣候急劇變化的影響下，敏感的荒漠生態系統勢必會受到影響，微生物的群落結構和種群、功能多樣性也會隨著環境的變化而改變，所以明確土壤環境對微生物的影響機制極其緊迫。

　　土壤不同的結構組成對微生物的分布有著極顯著的影響，土壤粒徑的空間分布決定孔隙的分布以及孔隙內空氣和水分，從而影響微生物與環境之間的物質能量交換，進而決定了微生物的生存空間。本研究采用Pearson相關性分析和DA分析得到細粉粒顯著含量影響細菌群落組成，粗粉粒、細粉粒和黏粒含量顯著影響細菌多樣性，細粉粒和黏粒含量僅與厚壁菌門正相關，與其他菌門均負相關，粗粉粒與細菌多樣性顯著正相關，由此說明細菌在0.05~0.02mm的土壤粒徑中適宜生存。

　　前人研究發現：影響細菌群落結構和多樣性的理化因子多為pH、全氮和有機碳[3，因為有機碳是微生物主要營養物質，氮元素能抑制微生物生長活性。而ang等[3對新疆干旱區不同類型土壤細菌群落多樣性的研究發現全鹽、氯離子、硫酸根離子和硝酸根離子對微生物的分布影響顯著，因為干旱區土壤類型為鹽堿化土壤，鹽離子是限制其微生物活性的主要因子，An等25對戈壁沙漠和塔克拉瑪干沙漠表面石礫樣品細菌多樣性的研究發現C/N影響微生物分布，而在本研究中土壤有效磷對細菌群落結構和多樣性的影響程度最顯著。

　　綜上所述：不同的研究區因環境差異較大而對土壤微生物分布影響表現出不同的因素，因不同的研究區域降水、光照、溫度等自然條件的差異，造就了特殊的土壤環境，從而產生了對土壤微生物影響顯著的因素。本研究土壤有效磷對細菌群落影響顯著一方面是因為荒漠土壤的pH較高且差異較小(8.519.40)，無法對微生物的分布造成顯著的影響，另一方面，根據土壤養分等級分級標準得本研究中土壤有效磷含量極高，可能因為較高含量的磷元素作用掩蓋了其他元素的作用。在荒漠土壤生態系統中，雖然真菌群落豐富度和多樣性遠不及細菌，但其生態功能對生態系統的穩定性亦不可或缺。為應對日益嚴重的環境問題，探明土壤環境對真菌群落的影響同樣重要。

　　曹良元34研究了土壤團聚體組成對微生物區系分布的影響，結果發現較大的團聚體中真菌的生物量較高，本研究Pearson相關性分析和DA分析表明細粉粒和黏粒與真菌多樣性呈極顯著負相關，與優勢真菌群落負相關說明真菌群落適合在較大土壤團聚體中生存。肖方南等35對塔里木河下游土壤真菌群落結構及多樣性分析發現全氮、速效鉀、銨態氮是影響土壤真菌群落結構的主要環境因子，因為氮和鉀影響微生物的新陳代謝，從而影響土壤真菌的群落結構，孫倩等28對寧夏中部干旱帶土壤真菌群落多樣性及群落結構研究發現有效磷影響真菌群落結構和功能多樣性，本研究中解堿氮和有效磷顯著影響真菌群落結構和多樣性，說明氮、磷元素對微生物的生存適應機制影響較大。

　　4結論

　　本研究采用高通量測序技術得到河西走廊荒漠土壤微生物群落結構和豐度特征，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、子囊菌門和擔子菌門由于其自身抗逆特性適應荒漠惡劣環境，并且可以改善荒漠土壤質量，促進植物生長發育，提高荒漠生態系統穩定性，同時研究發現黏粒、細粉粒、和OC顯著影響微生物群落分布，并探明理化因子及與優勢微生物相互關系。通過以上研究明確荒漠土壤微生物群落結構、多樣性及影響因素，表明土壤環境對微生物存在的影響及微生物對土壤生態系統發展的作用，為保護生物多樣性及荒漠生態服務提供理論參考。

　　參考文獻(References)

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　　作者：李善家1†，王福祥1，從文倩1，魏明1，王軍強2，崔莉娟1，王子濠

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