三七總皂苷白蛋白微球注射液在家兔體內的藥物代謝動力學研究

　　摘要:目的:對三七總皂苷白蛋白微球注射液(PNS-BSA-MS-inj)在家兔體內的藥物代謝動力學進行研究。方法:以新西蘭大白兔為模型動物，以血塞通注射液為對照制劑，關節腔注射PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液，運用UPLC-MS/MS技術檢測家兔體內人參皂苷Rb1的血藥濃度變化，同時建立人參皂苷Rb1的血漿定量分析方法。利用DAS2.0軟件分析PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液的藥物代謝動力學參數差異。結果:家兔關節腔注射PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液后，藥物代謝動力學參數如下:半衰期(t1/2)分別為59.350h和35.694h，藥峰濃度(Cmax)分別為34.340μg/mL和42.340μg/mL;達峰時間(tmax)分別12h和1h;藥時曲線下面積(AUC0-∞)分別為2265.702mg/(L·h-1)和1961.411mg/(L·h-1);PNS-BSA-MS-inj的相對生物利用度為116%。結論:與血塞通注射液相比，PNS-BSA-MS-inj能顯著提高藥物在家兔體內的滯留時間，并能提高藥物在家兔體內的生物利用度，說明PNS-BSA-MS-inj具有緩釋效果。

　　關鍵詞:三七總皂苷;白蛋白微球;關節腔注射;人參皂苷Rb1;UPLC-MS/MS

　　三七總皂苷(panaxnotoginsengsaponins，PNS)為三七的主要有效成分，目前研究表明其藥理作用廣泛，除具有抗炎、鎮痛、抗血栓、抗心律失常、抗氧化、抗腫瘤[1]等藥理作用外，還具有抑制促炎癥因子分泌、抑制金屬蛋白酶的活性、保護軟骨基質、抑制滑膜炎癥等作用[2]。

　　醫學藥物論文： 臨床藥學干預在抗菌藥物合理使用中的效果觀察

　　有研究表明采用膝關節腔內直接注射三七總皂苷及其制劑，可使藥物直接分布于病變局部，能夠改變骨性關節炎的病理狀態，從而發揮治療骨性關節炎或者骨折等疾病的作用，具有操作方便、起效快速、藥物易于吸收等優點[3，4]。但常規關節腔注射給藥，大量藥物滲漏進入體循環，藥物在關節組織滯留時間短，治療效果不理想，且需要頻繁用藥，不良反應大，病人的順應性差[5]。因此，注射用緩控釋制劑已逐漸成為關節腔注射給藥的研究熱點[6-8]。

　　白蛋白微球是一種可作為控制藥物釋放的新型給藥系統，由于其與人體組織的親和性較好，利用白蛋白將藥物制成微球后，不僅能夠顯著增加藥物在血漿的溶解性，提高藥物的選擇性和生物利用度[9]，包封在微球中的藥物還具有緩釋的作用，能在降低不良反應的同時具有延長藥效的作用[10]。為了延長藥物在關節腔內使用時間，本研究以牛 血清蛋白(bovinesrumalbumin，BSA)為載體材料，PNS為藥物通過加熱固化法制備得到三七總皂苷白蛋白微球，使其具有緩釋作用，提高生物利用度，降低給藥劑量。本實驗通過家兔關節腔注射PNS-BSA-MS-inj，以血塞通注射液作為參比制劑，采用UPLC-MS/MS法測定不同時間家兔血漿中的人參皂苷Rb1的含量，考察藥物在家兔體內的藥物代謝動力學特征。

　　1儀器與材料

　　1.1儀器WASTERSXEVOTQ超高液-質譜聯用儀(美國Waters公司)，AE/240型十萬分之一電子分析天平(上海梅特勒儀器有限公司)，TGL-16B型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，HC-2062型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，MTN-2800D型氮吹濃縮裝置(天津奧特賽思斯儀器有限公司)，MX-S型渦旋混合機(美國SCILOGEX公司)，SK8200H型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。

　　1.2藥品與試劑PNS-BSA-MS-inj(實驗室自制，平均粒徑為9.53±4.83μm，平均載藥量為6.87±0.03%)，注射用血塞通凍干粉(批號:F807036a3，哈爾濱珍寶制藥有限公司)，人參皂苷Rb1對照品(批號:110704-201625，中國食品藥品檢定研究院)，地高辛對照品(批號:133593，中國食品藥品檢定研究院)，生理鹽水(貴州天地有限公司)，甲醇(色譜純，美國天地公司)，乙腈(色譜純，美國天地公司)，屈臣氏蒸餾水(屈臣氏集團公司)，實驗室自制蒸餾水，其他試劑均為分析純。

　　1.3動物新西蘭大白兔，普通級，雌雄各半，體質量2.5～3.0kg，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK-(黔)2018-0001。

　　2方法與結果

　　2.1溶液的配制

　　2.1.1對照品溶液的配制精密稱取人參皂苷Rb1對照品10.68mg，加甲醇溶解并定容至10mL，即得濃度1068μg/mL人參皂苷Rb1的對照品溶液，置于4℃冰箱保存，臨用時稀釋成適當對照品溶液。

　　2.1.2內標溶液的配制精密稱取地高辛對照品2.4mg，用甲醇溶解并定容至25mL，即得濃度為96μg/mL的地高辛對照品溶液，置于4℃冰箱保存，臨用時稀釋成適當對照品溶液。

　　2.2血漿樣品的處理方法精密吸取地高辛對照品溶液10μL，加入到精密吸取的500μL血漿上清液中，渦旋混合1min，加入乙腈1490μL，渦旋混合3min，10000r/min離心15min，取全部上清液轉移至5mL一次性EP管，在50℃下N2吹干，用100μL的甲醇復溶，渦旋混合3min，超聲5min，10000r/min離心15min，取上清液用0.22μm微孔濾膜過濾作為供試品溶液，進樣5μL，進行UPLC-MS/MS法檢測分析。

　　2.3色譜條件采用XBridge�LUPLCCSHTMC18色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)-0.2%甲酸乙腈為流動相(B)，采用梯度洗脫(0min，80%A;3min，75%A;5min，60%A;7min，30%A;8min，10%A;9min，80%A;10min，80%A)，流速為0.3mL/min，柱溫為30℃，樣品室溫度為10℃，進樣體積為5μL。

　　2.4質譜條件采用電噴霧電離源負離子(ESI負源)模式，多反應檢測模式(MRM)。人參皂苷Rb1，地高辛的檢測離子對分別為m/z1107.6→179.1，825.4→825.3，毛細管電離電壓為3.0KV;離子源溫度為200℃;一級錐孔電壓為30V;脫溶劑氣體為N2，脫溶劑氣溫度為500℃;脫錐孔反吹氣流量為50L/h;溶劑氣流量為800L/h;碰撞氣體為Ar，碰撞氣流速為0.15mL/min。采用MRM模式，掃描范圍m/z100～1000;各個定量離子峰質譜條件，即碰撞能量與錐孔電壓。

　　2.5方法學考察

　　2.5.1專屬性考察分別將空白血漿(陰性樣品)，含一定濃度人參皂苷Rb1對照品及內標溶液(地高辛)的空白血漿(對照樣品)和關節腔注射PNS-BSA-MS-inj后的含藥血漿加入內標溶液的樣品(樣品)，按“2.2”項的血漿處理方法處理后分別得到陰性樣品供試液、混合對照品供試液以及樣品供試液，分別取各樣品進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，該方法專屬性良好，處理后供試液無雜質干擾，血漿內源性物質和其他代謝物在人參皂苷Rb1和地高辛附近無干擾雜峰出現，可用于人參皂苷Rb1和地高辛體內定量分析。

　　2.5.2線性關系的考察

　　分別精密吸取10μL不同濃度的人參皂苷Rb1對照品溶液置于離心管中，每濃度點各取平行樣3份，在50℃下使用N2濃縮儀揮去甲醇，精密加入空白血漿500μL，按照“2.2”項下進行處理，即得含人參皂苷Rb1當量濃度分別為0.267、0.801、2.403、7.209、21.627、64.881μg/mL的血漿供試液。以人參皂苷Rb1的當量濃度為自變量(X)，以人參皂苷Rb1的峰面積與內標物峰面積的比值為因變量(Y)繪制標準曲線，進行回歸方程分析。得人參皂苷Rb1的回歸方程為Y=1.087X-0.037，(r=0.995)。結果表明，人參皂苷Rb1的當量濃度分別在0.267-64.881μg/mL范圍內呈良好線性關系，可用于人參皂苷Rb1體內定量分析。

　　2.5.3精密度試驗

　　分別精密吸取2組低、中、高3個濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)的人參皂苷Rb1對照品溶液10μL，每個濃度平行樣5份，在50℃下于N2下揮干甲醇置于離心管中備用。于備用的離心管中加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法處理后，作為質量監控樣品供試液，其中1組1d內連續進樣3次，計算日內精密度;2組每天測定1次，連續測定3d，計算日間精密度。結果顯示人參皂苷Rb1的日內精密度RSD分別為18.36%、7.61%和6.87%，RSD均<20%;日間精密度RSD分別為19.40%、17.91%和7.61%，均<20%，基本滿足生物樣品體內定量分析質量規范要求。

　　2.5.4回收率試驗

　　(1)提取回收率試驗:分別用精密吸取低、中、高3個質量濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)工作液10μL，每個濃度平行樣5份，在50℃下N2下揮干甲醇于離心管中備用。加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法處理后，轉移上清液至備用的5mL的離心管中，于N2下揮干后同上復溶，作為A溶液;另用甲醇配制相應濃度的人參皂苷Rb1對照品溶液，不經提取進樣同量測定，并以此為標準，作為B溶液。

　　將A溶液和B溶液分別檢測分析，分別測定人參皂苷Rb1和地高辛的峰面積并計算兩種溶液的比值。結果顯示人參皂苷Rb1低、中、高3種濃度的提取回收率分別為(101.38±12.08)%、(88.82±13.97)%、(98.11±6.10)%，均>80%;RSD分別為11.92%、15.73%、6.21%，均<20%。(2)方法回收率:分別精密吸取低、中、高3個濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)的人參皂苷Rb1對照品溶液10μL，每個濃度平行樣5份，在50℃下于N2下揮干甲醇于離心管中備用，于備用的離心管中加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法處理，記錄人參皂苷Rb1和地高辛的峰面積，分別將人參皂苷Rb1和地高辛的比值，通過隨行標準曲線計算人參皂苷Rb1的濃度，與相應的標示濃度進行比較，計算方法回收率。結果顯 示，人參皂苷Rb1的低、中、高濃度方法回收率分別為(91.65±13.53)%、(116.59±5.75)%、(81.47±1.83)%，均>80%;RSD分別14.76%、4.93%和2.25%，均<20%。

　　2.5.5穩定性

　　分別用微量進樣器取低、中、高3個質量濃度(8.01、72.09、519.05μg/mL)工作液10μL，每個濃度平行樣5份，在50℃下于N2下揮干甲醇于離心管中備用。于備用的離心管中加入空白血漿500μL，其余按照“2.2”血漿樣品的處理方法操作，配制成低、中、高3個質量濃度的血漿樣品，分別放入-20℃條件下保存24h后反復凍融3次以及常溫下放置6h。每一濃度進行5樣品分析，結果顯示人參皂苷Rb1低、中、高3種濃度冷凍1d凍融3次的RSD分別為2.78%、12.29%和13.71%，均<15%，常溫下放置6h的RSD分別為11.55%、6.16%和12.48%，均<15%。說明樣品在常溫和-20℃條件下穩定性良好。

　　2.6藥物代謝動力學研究

　　2.6.1血漿樣品的采集與處理

　　取健康新西蘭大白兔8只，雌雄各半，體質量2.5～3.0kg，隨機分為兩組。分別于兔左關節腔注射1mLPNS濃度均為8.1mg/mL的PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液，給藥前禁食12h，自由飲水，每個時間點從耳緣靜脈取血2mL用于研究。第一組為對照組，注射血塞通注射液;第二組注射PNS-BSA-MS-inj。兩組分別于給藥后30min、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144h耳緣靜脈取血并放置于3mL預肝素化離心管中，搖勻，離心，4000r/min，15min，轉移上清液，置于-20℃冰箱保存待測。分別將兩組不同時間點的血漿按“2.2”項下方法操作，分別測定人參皂苷Rb1和地高辛的峰面積，帶入回歸方程，計算不同時間點的血藥濃度。

　　2.6.2藥物代謝動力學參數分析

　　關節腔注射血塞通注射液和PNS-BSA-MS-inj后，通過測定不同時間新西蘭大白兔血漿的藥物濃度，兩種制劑的藥物濃度與時間的關系曲線，采用DAS2.0藥物動力學程序，分別對血藥濃度與時間的關系采用統計矩法求藥物動力學參數。

　　2.6.3藥物代謝動力學研究結果

　　關節腔注射血塞通注射液和微球注射液后，血漿中人參皂苷Rb1濃度存在明顯差異。關節腔注射血塞通注射液，關節腔滲漏較多，血漿中人參皂苷Rb1濃度呈上升趨勢，1h達到最大值(Cmax=42.340μg/mL)6天后血漿中仍然存在人參皂苷Rb1(1.66μg/mL)，而關節腔注射微球注射液0.5h血漿中此時測不到血藥濃度;12h以后才達到最大值(Cmax=34.340μg/mL)，PNS-BSA-MS-inj比血塞通注射液的Cmax要小得多，說明關節腔注射PNS-BSA-MS-inj，關節腔滲漏進入血液循環的藥物量明顯減少，間接說明滲漏進入血液循環中的藥量少，在關節組織滯留時間長，能維持較高的關節局部濃度，提高療效。

　　由兩組藥物動力學參數結果顯示，PNS-BSA-MS-inj組半衰期和平均滯留時間都有延長(P<0.05)，且達到藥物濃度峰的時間明顯推后;PNS-BSA-MS-inj組AUC0-∞是血塞通注射液組的1.16倍。說明藥物經過微球包封，能夠起到減少藥物滲漏，從而使藥物長時間滯留于組織，維持局部的藥物濃度，提高藥物生物利用度。

　　3討論

　　本實驗以新西蘭大白兔為模型動物，以血塞通注射液為對照，地高辛為內標物，對PNS-BSA-MS-inj在家兔體內的過程進行了初步研究。在實驗中參考多篇文獻[11，12]并進行預實驗，最后確定流動相為乙腈和水，為了改善其和內標的峰型，在乙腈中添加0.2%的甲酸，在純化水中添加0.1%的甲酸。在血漿樣品處理方法過程中，曾選用乙腈和甲醇直接沉淀蛋白，結果發現血漿用量相同情況下，使用乙腈比甲醇的提取回收率提高近50%，故選擇乙腈作為蛋白沉淀劑進行后續實驗。

　　實驗發現在30℃條件下N2吹干耗時約2h以上，故筆者考察了人參皂苷Rb1在30℃、40℃、50℃條件N2吹干耗時時長，并通過UPLC-MS/MS法檢測其含量差異，發現50℃條件下N2吹干耗時只要1h左右，且含量與30℃、40℃條件下N2吹干相差不大，因此，在滿足生物樣品提取回收率的前提下，從經濟效益最佳的角度上，最終選擇乙腈作為蛋白沉淀劑，并在50℃條件下N2吹干進行后續實驗。

　　本實驗對PNS-BSA-MS-inj在家兔體內的藥物代謝動力學特征，藥物代謝動力學參數分析結果顯示:PNS-BSA-MS-inj組和血塞通注射液組t1/2分別為59.350h和35.694h，延長了1.66倍;平均滯留時間(MRT0-∞)分別為57.716h和52.210h，PNS-BSA-MS-inj組比血塞通注射劑組延長了1.11倍;PNS-BSA-MS-inj組AUC0-∞為2265.702mg/(L·h-1)，是血塞通注射液組的1.16倍。說明該制劑在家兔體內具有一定的緩釋作用，同時將三七總皂苷制成白蛋白微球之后，藥物被包封于微球，減少了藥物從關節腔向體內血液循環的滲漏，使藥物長時間滯留在關節腔內，提高了藥物的生物利用度，最終達到提高療效、提高患者順應性的目的。

　　參考文獻

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　　作者：楊姍，陳汝玲，吳靜瀾，田孟斌，楊光錦

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