單分子成像技術在工業微生物研究中的應用

　　摘要:在單分子工具和技術的迅速發展過程中,單分子熒光顯微鏡技術脫穎而出,可以高特異性地監測熒光標記的生物分子的時空行為,成為研究生物系統的有力工具。然而,單分子成像和追蹤技術在工業微生物研究及酶工程領域中的應用仍處于起步階段。隨著生物工程技術、合成生物學和代謝工程等科學技術的迅猛發展,工業微生物的應用日趨廣泛。但是,菌株往往難以在整個培養期間保持最大的生產能力,導致在經濟效益上不能滿足產業化的需求,成為制約微生物細胞工廠發展的一個瓶頸問題,對酶工程領域的酶學研究提出新的挑戰。單分子成像技術具有直接、準確、實時等監測優點,可以直接在活體生物上進行研究,成功地實現了對單分子酶的催化過程實時監控,發現了多種酶的新單分子行為及反應機制。這些技術有助于各種新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研發。本文簡述主要的熒光顯微鏡單分子成像和追蹤技術的特點,總結近年來單分子成像技術在微生物研究、酶工程領域的酶學研究中的應用,及其在工業微生物研究中的應用現狀和面臨的挑戰。這些技術的應用必將促進納米生物學的發展,推動酶的工程改造,提高細胞工廠的生產能力。

　　關鍵詞:單分子成像單分子追蹤工業微生物酶工程熒光顯微鏡

　　0引言

　　隨著環境保護和可持續發展的強烈需求,綠色制造倍受關注。現代科技的迅猛發展提升了生物工程、代謝工程、合成生物學等領域的創新能力,工業微生物的應用也日趨廣泛。然而,作為生產單元的底盤細胞,活的微生物菌株不斷對生產過程中的各種應激做出響應,難以在整個培養期間保持最大的生產能力,導致在經濟效益上無法滿足產業化的要求。這個制約微生物細胞工廠發展的瓶頸問題,對酶工程領域的酶學研究提出了新的挑戰。

　　微生物論文范例： 典型油田區油污土壤微生物群落區域性分布研究

　　單分子成像技術具有獨特的監測優點,可對活體生物實施直接、準確、實時的觀察,實現對單分子酶催化過程的實時監控。這些技術的應用使多種酶的新單分子行為及反應機制被發現,促進了各種新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研發。在各種單分子工具和技術中,單分子熒光顯微鏡技術脫穎而出,它能夠高特異性地監測熒光標記的生物分子的時空行為,成為研究生物系統的有力工具。目前,在工業微生物及酶工程領域的研究中,單分子成像和追蹤技術的應用亟待提高。本文從單分子成像的主要技術特點及其在微生物研究和酶學研究中的應用,在工業微生物研究中的應用和挑戰等4方面探討了相關內容,旨在推動酶的工程改造,提高細胞工廠的生產能力。

　　1單分子成像的主要技術特點

　　單分子工具和技術涉及面廣,包括原子力顯微鏡、單分子熒光顯微鏡、光鑷、磁鑷、納米孔鑷以及增加可觀察物數量的混合技術[1]。這些方法可以通過施加力和力矩,操縱單個生物分子,觀察單個運動復合體的動態構象變化。其中熒光顯微鏡具有極高的對比度、標記的特異性、對生物樣品的干擾相對較小的特點,伴隨著監測器、染料技術和圖像分析方法的技術進步,單分子熒光顯微鏡技術脫穎而出,成為研究生物系統的有力工具,因為它可以高特異性地監測幾乎任何熒光標記的生物分子的時空行為。這樣的“超分辨率”顯微技術,就是以比光學分辨率極限更高的精度呈現空間信息的光學成像技術[2]。

　　實現超分辨率的最簡單方法是避免在遠場區域成像,執行近場成像(即熒光源和檢測器之間的距離小于幾個波長的光),從而避免受到顯著的光學衍射效應的影響。單分子定位顯微鏡具有兩方面功能,單分子成像能夠在納米尺度上解析生物結構,單分子追蹤可以在毫秒范圍內監測分子間相互作用。其基本工作原理是通過控制單個熒光團的熒光發射,實現比傳統熒光顯微鏡方法更高的分辨率。隨著時間的推移,通過“閃爍信號”策略可以獲得不同小熒光團子集的圖像,并且可以高精度定位每個單獨熒光信號的質心,以創建詳細的分子圖和納米尺度的超分辨圖像[3]。

　　單分子定位成像中最常用的熒光團是熒光蛋白和有機染料。熒光蛋白具有遺傳標記的優勢,具有β

　　2單分子成像技術在微生物研究中的應用

　　活體微生物細胞內蛋白質研究經歷了細胞整體、單個細胞、亞細胞、低拷貝單分子、任意低拷貝單分子的發展過程[5]。在活的微生物細胞中實現單分子檢測存在三大障礙,即受到靈敏度、空間分辨率和光穩定性的限制。綠色熒光蛋白(GFP)的出現,提供了一種標記蛋白質的簡單的基因方法,該方法能夠標記細胞中許多不同的生物分子,使對細菌的研究從群體研究快速過渡到單細胞研究,實現了許多細菌蛋白質、染色體和質粒DNA以及膜結構的亞細胞分布的成像,成為微生物研究中的里程碑[6]。對活細菌進行的第一次單分子熒光研究使用了熒光探針的多個拷貝,檢測細胞中的信使RNA(mRNA)分子。

　　一個流行的系統依賴于RNA發夾和MS2噬菌體衣殼蛋白之間的高親和力相互作用;通過在相關mRNA中引入發夾的多個重復序列,并表達與GFP衍生物融合的MS2蛋白,可以間接地用GFP標記mRNA分子。在裂變酵母中,將一種快速成熟的黃色熒光蛋白(YFP)基因與一種膜定位蛋白片段(Tsr)的染色體拷貝進行基因融合,通過lac操作子控制YFP

　　雙標記系統通過DNA結合蛋白與插入細菌染色體或質粒的特定DNA序列基序的相互作用來“標記”DNA上的特定位點。例如,熒光阻遏算子系統(基于轉錄阻遏,如lacI和tetR);parB

　　單分子定位和追蹤技術已廣泛用于微生物研究中,包括DNA修復[8

　　例如,通過鞭毛將含有MotB

　　3單分子成像技術在酶學研究中的應用

　　對于酶工程領域來說,酶學研究正處于一個拐點。在分子生物學技術的推動下,酶工程技術獲得了突破性的發展,通過開創性地借助分子生物學的方法進行快速而廣泛的分子定向進化,從而改變酶的功能或特性,推動了酶工程的應用價值[27]。而且,改良的DNA技術、各種生物信息學中的新工具,以及新時代對“綠色催化”的強烈需求,都推動和促進了酶工程的發展[28]。對酶制劑的需求不僅局限在傳統領域,在新興領域酶制劑也獲得了廣泛應用[29]。制藥、環境、精細化學品等領域對酶制劑的迫切需求,推動和促進了各種新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研發[6]。

　　這些研發涉及創造新的,通常是具有非天然催化活性,或者非天然底物反應等的新酶。這些新酶的研發可以為使用化學合成工藝的傳統制藥領域帶來新的、可持續的綠色催化工藝,而且可以引入更具有特異性的催化路線[30]。然而,這對研發新特性酶的酶工程而言提出了更高的挑戰。在現階段,酶學研究和酶工程改造通常依賴于已知酶的蛋白質結構。例如,纖維素酶的蛋白質工程主要有兩個趨勢:第一,計算蛋白質工程的結果對于推動該領域的研究越來越重要,因為實驗設想和結果仍然很少;第二,進一步研究纖維素水解的輔助蛋白,如溶解性多糖單加氧酶(LPO),以改進纖維素酶的屬性和結構[31]。

　　由于蛋白質結晶和蛋白質結構解析的工作費時費力,大部分酶都沒有提供蛋白質結構信息[32],因此,以往在對酶分子改造的研究中,假設在反應條件下(低酶濃度、高底物濃度、有機溶劑等)酶的結構與結晶酶(高酶濃度,無底物和/或有機溶劑)的結構非常相似,在此基礎上進行各種研究。實際上,酶在不同條件下的分子作用方式差異極大[33],根據結晶酶及其催化反應條件等來設計酶的改造策略往往是失敗的。

　　因此,對于酶工程研究來說,急需一種快速直接的蛋白質特性分析手段,為酶工程改造提供技術支撐。單分子成像技術具備這個優勢。利用單分子成像可以直接對單分子酶的催化過程實時監控,直接觀察到蛋白質在各種不同條件下的作用方式,特別是單個蛋白質的各種氨基酸殘基的作用力學變化,這個優勢使得研究人員可以根據每個催化反應來觀察分子變化,從而加速了催化策略或分子改造策略的實施方案[34,35]。

　　單分子酶蛋白質研究是新近隨著分析儀器的更新和進步,在生命科學領域開拓出來的新熱點和新技術手段。生物學中的各種反應,都是由單個分子的各種反應聚集而成的宏觀現象。實際上,分子相互作用和化學反應總在單分子的水平上發生,但由于研究手段的限制,各種化學反應和生物反應的數據幾乎都是從含有大量分子的實驗中得到的。對于由微觀匯集成宏觀的生物反應過程,利用傳統的研究手段無法探觸到反應的本質,只能是采用間接的方法,通過宏觀的現象變化推測分子級別的反應特性。隨著生命科學中分析儀器和分析技術的發展,對單個分子進行分析成為可能。從20世紀90年代中期開始,許多研究人員轉向室溫單分子檢測,尤其是生物體系的單分子研究,實現了對活細胞單分子生化反應的高特異性、毫秒時間分辨率的探測。

　　在過去的十年中,科學和技術的進步使生物催化成為實驗室和工業規模化學合成中,傳統金屬和有機催化實用和環境友好的替代品。隨著DNA測序和基因合成技術取得的關鍵進展,在通過蛋白質工程和設計裁剪生物催化劑以及將酶重組為新的生物合成途徑的能力方面取得了巨大進展[36]。由于單分子技術具有避免集群研究的平均效應、捕獲瞬態中間產物和表征非均一行為等優勢,使科研人員得以探觸到生物反應的本質變化,從而使生物學的許多領域取得重要突破。

　　利用單分子成像技術在研究酶和DNA的相互作用方式中,誕生了單分子測序方法,即現在所稱的第三代測序技術。單分子測序不需要任何PCR的過程,有效避免了以前的測序方法因PCR偏向性而導致的系統錯誤,同時具有提高讀長,并保持二代技術的高通量,低成本的優點,從而實現了技術上的大跨越。利用單分子原理的測序技術儀器也得到推廣,并且逐步取代在2008年才面世的第二代測序儀器,進入第三代測序時代[37]。單細胞基因組學通過單分子技術與基因組學的交匯,實現在單細胞中檢測基因拷貝數以及單個點突變。與此同時單分子成像技術用于追蹤運動軌跡,探明細胞中單個分子或單個粒子的運動表現[38]。

　　所以,單分子實驗的研究結果不僅是對以往總體平均研究方法的有力補充,而且在許多方面單分子技術已成為深入研究酶的生物活性不可或缺的手段。單分子成像技術在酶工程研究中得到應用,如對分子馬達機械力化學耦合的深入分析使人工工程馬達的發展成為可能。分子馬達是一種將化學能轉化為機械能的酶,在這種酶的作用下,它可以執行關鍵的細胞功能,如DNA復制和轉錄、DNA超螺旋、細胞內運輸和ATP合成。單分子技術已被廣泛用于識別分子馬達反應循環中的結構中間體,并了解能量消耗的子步驟如何驅動中間體之間的轉換。這些技術被應用于研究各種馬達,如螺旋酶、DNA和RNA聚合酶、拓撲異構酶、核小體重組子,以及參與DNA縮合、分離和消化的馬達[1]。

　　通過突變、化學修飾和光遺傳學等技術,重新設計現有的分子馬達,例如改變速度、過程性或功能性[1,39]。基于單分子成像和單分子生物學的研究結果,實現了在活細胞里直接觀測生物大分子。中國科學院上海生物化學研究所分子生物學國家重點實驗室的研究團隊鑒定了兩種核酸內切酶缺陷、單組分可編程RNA引導和RNA靶向Cas13RNA酶(dCas13),可對活細胞中的RNA進行穩健的實時成像和跟蹤。

　　dCas13和dCas9(Cas9的突變形式,其內切核酸酶活性通過點突變被去除)系統的進一步組合允許同時可視化活細胞中的基因組DNA和RNA轉錄[40]。使用納米拷貝技術可以放大單個標記基因,從而能夠在擁擠的細胞內環境中,在可尋址的亞衍射體積中進行單分子檢測,實現以單分子分辨率對RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)進行成像、跟蹤和量化,揭示其在轉錄周期中的動態,并進一步研究多個功能相關事件—調節因子—染色質相互作用、PolⅡ動力學和新生轉錄動力學,揭示了迄今為止在體內未發現的基因調控機制的詳細操作參數[41]。此外,一種基于納米結構的雙色熒光探針,通過雙色共定位成像提高了測量精度,從而大大避免了假陽性信號,并實現了活細胞中微小RNA的實時原位成像,推進了在單分子水平上對活細胞中各種生物分子進行無酶放大監測和成像[42]。

　　4單分子成像技術在工業微生物研究中的應用和挑戰

　　隨著生物工程技術和計算機輔助設計的迅猛發展,工業微生物的應用日趨廣泛。近年來,新的合成生物學方法提高了原始菌株的高附加值次級代謝產物的產量,新的生物合成基因簇的挖掘和構建開辟了工程菌株的應用途徑[43]。代謝工程提供了以可再生方式生產新分子的極好能力,拓寬了通過細胞系統從化學元素合成有用產品的范圍,加速了生物燃料、生物材料和納米技術的應用[44]。但是,隨著培養條件和細胞狀態的動態變化,底盤細胞不能在整個培養期間保持最大的生產能力,在經濟效益上不能滿足產業化的需求,成為制約微生物細胞工廠發展的瓶頸。

　　工業微生物在發酵過程中通常作為活細胞催化劑,常用的工業微生物有細菌、放線菌、酵母菌和霉菌。單分子成像技術在工業微生物研究中得了到應用。德國馬克斯普朗克陸地微生物研究所的研究團隊詳細總結了單分子成像技術在微生物研究中的應用現狀特點[3]。

　　可見該領域的研究現狀有以下特點:①單色研究為主,多色研究尚不多見;②大多數研究在模式微生物進行;③結構成像較多,單粒子追蹤很少;④大多數研究按時間順序記錄不同的靶點,并行成像較少;⑤在各種標記方法中,最主要的是基因標記,特別是熒光蛋白融合;⑥成熟的多色標簽不多。因此,單分子成像技術在工業微生物研究中的應用仍處在起步階段。這是因為其在實際應用中面臨諸多挑戰。 微生物細胞是小而密集的單細胞有機體,其特點是具有強大的細胞壁保護,特定的自體熒光或彩色色素背景,蛋白質的拷貝數相當低,生長速度和新陳代謝速度卻相當快[3]。

　　在微生物細胞中進行單分子檢測是一項復雜的工作,這是因為其中存在復雜的擴散模式;許多熒光蛋白傾向于寡聚,扭曲的相互作用會使蛋白質的定位和聚集狀態發生改變;在同一個細胞中進行雙色/多色測量,共定位檢測技術相當復雜;準確計算分子數量是復雜的,可能出現計算不足或過多的情況,需要有每個特定的熒光蛋白在特定的細胞環境中檢測效率的知識。

　　蛋白質完全熒光融合的方法在應用中仍然存在限制,難以處理中到大拷貝數的蛋白質,因為它們會使典型的細菌細胞過于熒光“擁擠”。因此很難研究大多數蛋白質在活細菌中的自然拷貝數行為。對低拷貝數的需求也妨礙了從單個細胞收集大量統計數據,從而限制了研究分子異質性的機會,這種異質性可能反映化學異質性(共價或非共價)或不同的細胞環境[5]。標記分子的正常生理功能可能受到干擾。

　　例如,在DNA上標記標簽可能會干擾局部染色質的結構和功能;內切酶(TALE,Cas9)或抑制物與染色質的結合可能干擾基因轉錄;將多個適配體外殼蛋白標記到單個mRNA會顯著增加mRNA的大小,從而干擾轉運動力學;蛋白質標記的潛在缺陷可能源于內源性標記和外源性標記分子之間的差異;大多數單分子成像都是在外源蛋白上進行的,由于靶蛋白的過度表達,很可能會產生人為的效應。

　　CRISPR/Cas9系統等基因工程技術可以有效地將標記模塊插入靶標分子的內源性基因組位點,使融合分子在生理水平上表達,實現在生理相關水平上對靶標分子進行成像[22]。熒光探針的不理想性能和光毒性,可能導致對單分子數據的不精確甚至不正確解釋。蛋白質停留時間的計算取決于標記熒光團的光穩定性,胞內成像所需的標記性能與現有的探針相比還有很大的差距,長期、連續、快速、低光毒性的單分子成像需要更明亮、更穩定、更簡單的探針和標記方法,有待開發用于活細胞單分子成像的優秀探針。

　　進一步優化非傳統熒光團,例如納米體、量子點、共軛半導體聚合物點和碳納米點,可能成為活細胞單分子成像的優秀探針[4]。對于單分子動力學和細胞行為之間的聯系,目前大多數實驗都是在體外培養的細胞系上進行的,由于光的散射,很難在生物體內實現單分子成像。另外,組織細胞在培養皿中的培養和馴化可能引起細胞性狀和組織成分的改變,可能會導致對結構與功能關系的誤解。大體積的高速成像是光片顯微技術進一步發展的重要方向;自適應光學、光片顯微鏡和明亮的基因編碼標簽的結合將使單分子成像更加深入[4]。

　　當底物和酶以很低的拷貝數存在時,還應考慮生化反應的波動,許多過程具有區隔效應,在限制拷貝數的過程多功能蛋白質中之間存在競爭,無法復制構成活細胞自然環境復雜的生物分子混合物[5]。現有的成像工作已是“大數據”項目,所提供的大數據集,需要復雜的圖像和時間序列分析來探測蛋白質的位置和流動性。大數據集的可用性以及定量的、統計上可靠的、基于成像的活體內分子特性信息,從活體內的分子擴散到復雜的基因網絡和分子機器的功能,也為構建描述許多過程的數學模型提供了極好的輸入[45]。

　　伴隨著合成生物學家生產的工程合成細胞、成像分辨率和通量的提高,將進一步擴大數學模型的應用范圍。許多因素會影響微生物細胞內單分子成像的性能,需要進一步提高單分子成像的性能。可通過擴展研究方法,如改進的熒光團和標記方法,高級微拷貝、分辨率更高、內容更豐富、照片損傷更低的成像技術,力傳感器,微流體,數據分析程序,數學建模等,增強單分子成像的能力和適用性[46]。

　　所有使用的單分子工具都已接近當前的技術極限。在用納米技術研究納米生物學問題時,每一項新技術的發展和應用都離不開方法的改進。一個懸而未決的問題是如何追蹤動態、協同移動的交互靶標。探針的發展可能改變當前的技術限制,包括研發能長時間和更精確地追蹤不同微生物靶點軌跡,能標記更小靶點的探針,不干擾細胞生物學,高標記密度和效率的探針[3]。

　　采用盡量減少樣品體積,設計光穩定性更好的熒光蛋白新變體,提高相機探測器的靈敏度,以提高信號的檢測能力。開發各種分析工具來提高信噪比,如細胞圖像的自動“分割”方法,用于追蹤熒光標記分子的穩健軟件算法,追蹤分子形成的分子絡合物的化學計量分析。對細胞工廠中生產單元的細胞進行單分子成像分析,可借助微流控裝置,控制菌細胞的大小或形狀,將細胞引入不同的微環境,測試對環境暴露的反應,或監測不同菌株之間的相互作用(合作或對抗)[46]。

　　5展望

　　單分子成像和追蹤技術實現了對細胞內部生命的直接可視化和原位測量,對理解生物過程至關重要,在生物學研究中帶來了許多深刻的發現。單分子成像和追蹤技術在工業微生物中的研究仍處在起步階段,在實際應用中仍面臨諸多挑戰。展望未來,單分子成像和追蹤技術的應用必將促進納米生物學的發展,推動酶工程改造,提高細胞工廠的生產能力。

　　參考文獻

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　　[3]VOJNOVICI,WINKELMEIERJ,ENDESFELDERU.Visualizingtheinnerlifeofmicrobes:Practicesofmulti

　　作者：嚴少敏,吳光

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