生物正交反應及其在藥學中的研究進展

　　摘要:最近二十年見證了生物正交反應在生物體系中尤其是在活體中的廣泛應用.由于其高度的專一性、較高的反應速率和良好的生物兼容性,生物正交反應為化學生物學的發展和研究生命進程帶來了革命性的技術方法.本文首先簡要介紹金屬催化的偶極環加成反應、疊氮-烷烴的環化加成反應、逆電子需求的狄爾斯-阿爾德環加成反應和光催化的生物正交反應;然后總結了其在藥物化學中的研究進展,包括該反應在藥物靶點驗證和活性分子結構發現等方向的研究概況;最后在此基礎上對該技術在藥物化學中的挑戰和未來發展進行了展望.

　　關鍵詞:生物正交反應; 藥物化學; 蛋白質標記; 活體應用; 定點修飾

　　生物正交 反 應 (Bioorthogonalreaction)是 一 類能夠在生物體環境系中尤其是在活體動物內進行、且不與 周 圍 其 它 生 物 化 學 過 程 相 互 干 擾 的 化 學 反應[1-2].由于生物體系的復雜性,具有高度專一性和快速反應能力的生物正交反應是化學生物學領域的重要前沿,為科學家們研究生命進程帶來了革命性的技術方法,對生物體系的標記和功能調控有著重要應用.生物正交反應通過化學和生物反應來選擇性地高效修飾報告基團在靶標上。

　　其主要反應類型包括初期K.B.Sharpless和 M.Meldal教授發現的銅催化的疊氮和末端炔基之間的1,3-偶極環加成反應(coppercatalyzedazide-alkynecycloaddition,CuAAC),以及Bertozzi教授等改進的環張力型炔烴參與的無金屬催化 劑 使 用 的 環 加 成 反 應 (strain-promotedazidealkynecycloaddition,SPAAC).研究者們后來發現帶有環張力的烯烴也可以發生類似的環加成反應,尤其當采用四嗪和反式環辛烯時,由于受環辛烯環內張力釋放和生成氣態副產物的雙重驅動作用,該逆電子需求的狄爾斯-阿爾德(inverse-electron-demandDielsAlder,IEDDA)反應的反應速率遠大于之前的反應,并能夠用于活體成像等體內生物標記反應.除反式環辛烯外,環丙烯、降冰片烯、氮雜環丁烯等具有張力的小環烯烴也可與四嗪快速反應.這些革命性的化學技術極大地促進了化學生物學這個新興交叉領域的發展.

　　2000年,Bertozzi課題組開發出能夠用于化學修飾細胞表面的Staudinger偶聯反應,逐漸開啟了生物標記領域的研究熱潮.經過20年的發展,由于具有特異性位點標記的優點[2],生物正交反應已被研究人員廣泛使 用 在 復 雜 生 物 體 系 中 標 記、分 離 和 研 究 蛋白[2]、糖類[3]、脂類[4-5]等不易或者不能通過基因方式修飾的生物活性分子,在活細胞成像、疾病診斷和生物組學分析中發揮了重要的作用.我國的研究者也在該領域做出了杰出的貢獻[6-7],也綜述介紹了生物正交反應的原理和研究現狀.陳鵬等課題組在生物正交反應[8-9]、位點特異性標記蛋白[10]及其生物正交剪切反應(bioorthogonalcleavagereactions,BCRs)[11]等方面分別總結了該領域的進展,該課題組也綜述報道了生物正交反應在我國的研究進展[12].圍繞IEDDA剪切反應在生物正交化學領域的發展與生物學研究中的應用尤其是生物成像也有很好的綜述報道[13].

　　近年來,生物正交反應在生物醫藥研究中也有廣泛的應用前景.本文首先簡要介紹生物正交反應的主要類型;然后總結其在藥物化學中的研究進展,包括該反應在藥物靶點驗證和藥物活性分子骨架發現等方向的研究進展;最后在此基礎上對該領域在藥物化學發展中的挑戰和未來發展方向進行了展望.

　　1 金屬催化的生物正交反應

　　1.1 銅(Cu)催化的生物正交反應生物正交反應的最顯著要求之一是反應具有較高的反應速率,而之前發現的大部分反應都難以滿足這個條件.一價銅離子催化的疊氮化合物與含有末端炔烴 的 環 加 成 反 應 CuAAC 即 “點 擊 化 學 (clickchemistry)”是發現最早、研究最多的生物正交反應之一.

　　疊氮化合物與炔基之間的環加成反應最早是由Huisgen于1963年發現的,但是該環加成反應條件苛刻,且 反 應 速 率 較 慢,而 K.B.Sharpless 和 M.Meldal兩位教授于 2002 年發現一價銅離子能夠顯著加快疊氮化合物和炔基之間的環加成反應,該反應條件溫和,只要在室溫條件下即可進行,且反應速率大大加快,約為之前的一百萬倍[14-15].將化學反應應用到生物體中首先必須要考其慮毒性問題,而前文提到的在生物正交反應中起催化作用的一價銅離子能夠參與產生對生物體系有毒的活性自由基,嚴重影響一價銅離子催化的反應應用.

　　為了解決這一問題,研究者們發現,加入配體與銅離子形成配合物能夠有效地降低毒性,也可增加該一價銅的穩定性并加快反應速率,這種優化方式被稱作由配體輔助的 CuAAC.目前已知的配體有寡聚三氮唑類化合物 TBTA[16]和水溶性較好的 THPTA[17],以及其它 TBTA 的水溶性類似物(如 BTTAA、BTTES、BTTP和 BTTPS)[11,18],天然氨基酸組氨酸也可有效輔助 CuAAC反應且幾乎無細胞毒性.除了通過配體螯合銅離子來降低生物毒性、提升反應速率之外,對 CuAAC的反應底物進行特定的修飾也能夠使反應速率進一步加快.一種常用的方法是在疊氮基的鄰位用吡啶來修飾(如疊氮基甲基吡啶),疊氮化合物中的吡啶能夠與銅離子螯合,從而使銅離子更快地參與反應[19].Wu等發現,當吡啶上含有供電子基團時,能進一步加快反應的速率[20].除了 CuAAC偶聯反應之外,銅催化的生物正交剪切反應也被報道[21].

　　陳鵬等發展了“雙取代炔丙基/銅試劑”,通過炔丙基的剪切調控,實現了非天然氨基酸定點插入的細胞膜表面受體-配體相互作用的原位調控[22].這種策略也可拓展至基于氨基或者酚羥基的 ADCs,這種分子內剪切反應可以實現選擇性殺傷癌細胞.

　　1.2 鈀(Pb)催化的生物正交反應鈀作為有機合成中常用的高效催化劑,在生物正交反應中也擁有巨大的應用潛力.鈀催化的蛋白質和小分子的偶聯反應在初期并不理想,直到 2009 年,Davis課題組開發了一種水溶性配體—ADHP(2-氨基-4,6-二羥基嘧啶)[23].ADHP 與醋酸鈀共存時能夠高效地催化帶有碘苯基的蛋白質與多種苯硼酸類化合物的 Suzuki-Miyaura反應.

　　兩年后,Lin課題組對 ADHP進行了結構優化,發現 N,N’-二甲基化的DADHP能夠和醋酸鈀在細菌體內實現 Sonogashira偶聯反應以標記蛋白質[24].隨著對鈀催化生物正交反應研究的不斷深入,研究者發現即使不使用配體也能用鈀高效地催化生物正交反應.陳鵬課題組設計了一種無需鈀催化的 Sonogashira偶聯反應,能夠對活細胞內位點特異的蛋白質進行標記.該課題組發現用 PEG 鏈來連接染料和反應基團時,只需要硝酸鈀即可實現對大腸桿菌內蛋白質的 Sonogashira偶聯標記細菌,不但效率高,而且沒有細胞毒性[25].

　　曲曉剛課題組開發出了一種能夠被光調控的納米鈀催化劑(如圖3所示),這種催化劑中的鈀被負載在由偶氮苯和β-環糊精的超分子復合物修飾的大孔二氧化硅中,在光照條件下偶氮苯的構型發生變化從而誘導β-環糊精分子的解離從而恢復鈀的催化活性,實現了細胞內的 Suzuki-Miyaura偶聯反應[26].

　　生物正交反應除了常見的偶聯反應外,還有生物正交剪切反應,而鈀催化的生物正交剪切反應也有著廣闊的應用前景.鈀介導的炔丙基/烯丙氧羰基的脫除反應是生物正交剪切反應中應用最多的反應之一(如圖4所示).陳鵬課題組在2014年首次報道了該類鈀催化的剪切反應,在活細胞內利用鈀催化脫除了炔丙基,完成了賴氨酸的“化學脫籠”,以此實現了細胞內蛋白質的原位激活[27].該課題組還將這類方法應用于酪氨酸依賴的蛋白質功能原位調控方法[28].

　　2 無需金屬催化的生物正交反應

　　2.1 環張力誘導的環加成反應(strainpromotedcycloadditionreaction)金屬催化的疊氮和末端炔基之間的環加成反應是使用最為廣泛的生物正交反應,由于金屬離子會產生細胞毒性,研究者們通過對炔基底物進行結構改變開發出了不需要銅離子催化的疊氮-炔基[3+2]環加成反應(strainpromotedazide-alkynecycloaddition,SPAAC).

　　早在2004年,Bertozzi課題組使用八元環炔基作為 底 物 與 修 飾 在 細 胞 表 面 的 疊 氮 基 團 進 行SPAAC反應,沒有發現明顯的細胞毒性,但是其與疊氮化合物反應的速率較低[39].為了提高該反應效率,Bertozzi,Boons等研究者們在八元環上進行結構優化[40-42],發現了更多反應速率快的環辛炔的衍生物[43-44],其中最快的二級反應速率達到了4.0M-1·s-1.最近,Franzini課題組系統綜述了包括SPAAC在內的無需金屬催化的生物正交反應的機理和取代基的反應,預期對該領域將起到很好的總結和啟發作用[45].

　　硝酮也可以替換疊氮作為一種活性基團參與疊氮-硝酮環加成反應(strain-promotedalkyne-nitronecycloaddition,SPANC),其反應速率比相同條件下的SPAAC反應要快30多倍[46].Pezacki課題組發現環狀硝酮與八元環炔的SPAAC的反應更快,并成功地實現對細胞表面蛋白質的特異性染料標記[47].

　　2.2 逆電子需求的狄爾斯-阿爾德反應(IEDDA)傳統有機化學中,狄爾斯-阿爾德(DA)反應是指發生在富電子雙烯體和缺電子親雙烯體之間的[4+2]環加成反應.與之相反,發生在缺電子雙烯體和富電子親雙烯體之間的[4+2]環加成反應被稱為逆電子需 求 的 狄 爾 斯-阿 爾 德 反 應 (inverseelectrondemandDiels-Alderreaction,IEDDA).反應生成的中間體具有高度環張力,會迅速脫去一分子氮氣,最終生成六元環噠嗪分子(如圖9所示)[48].這種反應不需催化劑和外源能量驅動就能直接發生特異性偶聯反應,且具有生物兼容性好、反應專一性高和反應速率快的優點,這使得該反應成為最受關注的生物正交化學反應.

　　2008年,Fox研究組和 Hilderbrand課題組分別獨立 報 道 了 這 類 IEDDA 反 應 在 生 物 體 系 中 的 應用[49-50].此后,研究者們發展了不同的環式烯烴和四嗪分子衍生物(如圖10所示)[51-52],將IEDDA 反應成功應用與熒光物質的“增強(turnon)”和蛋白的定點修飾中.

　　傳統方法集中在高度對稱的四嗪衍生物,該領域的研究者發現四嗪的3,6位鏈接吸電子基團時反應效率較高,但是隨著深入研究,發現3位和6位的連接基團的選擇極為復雜.陳鵬課題組設計了不對稱四嗪衍生物,結果表明在3位連接吸電子基團,在6位連接非吸電子基團能夠使反應活性與分子穩定性達到最佳平衡,成功地實現了活細胞內的快速生物正交反應[53].此外,Weissleder研究者發現四嗪所連接的酸性基團也會影響反應速率,并提出了“局部酸催化理論”[54].結果表明,在形成雙環中間體之后,3位或6位的酸性基團會參與到下一步的異構化反應之中,動力學上利于發生后續消除反應,且基團的酸性越強,反應速率越快.

　　3 光催化的生物正交反應

　　相較于金屬催化的生物正交反應,光介導的反應由于其利用外源光的便捷性和可控性,在時間分辨等方面具有天然的優勢,近年來得到了廣泛的關注.

　　3.1 紫外光催化的1,3-偶極環加成反應1,3-偶極環加成反應在無金屬催化下也得以成功實現.由于二芳基取代的悉尼酮在紫外光的照射下會快速生成高活性的1,3-偶極中間體,與烯烴發生[3+2]環加成反應,余志鵬課題組通篩選出了高活性二芳基取代悉尼酮,與不同烯烴、炔烴進行組合,構建了多種生物正交偶聯反應類型,從而實現對生物體系中不同多肽和蛋白質的選擇性標記[70].

　　四氮唑在被紫外光照射之后生成的活潑1,3-偶極子,與烯烴快速發生環加成反應,是光點擊化學反應的代表性反應之一.熒光化合物被四氮唑修飾之后通常會處于淬滅狀態,而當四氮唑與烯烴發生環加成反應之后會恢復熒光.利用這一原理可對特定的蛋白質進行標記.在大腸桿菌與哺乳細胞 HEK293的蛋白中定點插入了含有雙鍵的人工合成非天然氨基酸,然后加入四氮唑修飾的無熒光染料進入細胞.

　　Lin等發現在365nm 的紫外光照射下,染料在大腸桿菌與 HEK293細胞中均恢復相應的熒光,這得益于四氮唑與非天然氨基酸的雙鍵在細胞中的快速環加成反應[71].該課題組還開發了帶有含有雙環烯烴的效率更高的反應,其二級速率常數高達(1850±218)L·mol-1·s-1,可以更有效定點標記綠色熒光蛋白[72].

　　4 生物正交反應在藥學研究中的應用

　　4.1 生物正交反應在活性藥物分子發現中的應用在生物體內,小分子在特定作用器官或病灶位點的原位自組裝是一種發現藥物活性分子的極具優勢的潛在方法[79].利用生物正交反應尤其是疊氮和末端炔基之間的環加成反應把兩個藥物片段原位連接,可用于設計靶點蛋白的抑制劑(如圖18所示)[80].利用這種方法,研究者們通過庫篩選的方法獲得了活性較好的乙酰膽堿酯酶、碳酸酐酶等酶抑制劑[81].

　　作為生物正交反應中反應速率最快的反應,逆電子需求的狄爾斯-阿爾德(IEDDA)反應可在細胞中用于發現活性藥物分子[82],AstexPharmaceutical公司的研究表明,四嗪和反式環辛烯介導的反應可以在活細胞中 將 BRD4 或 ERK1/2 抑 制 劑 與 E3 連 接 酶CRBN 的配體thalidomide連接起來(如圖19所示),能夠快速優化連接方式得到活性很好的 PROTACs分子[83].

　　4.2 生物正交反應在靶向藥物遞送和前藥設計與激活中的應用除了在細胞中篩選活性分子之外,生物正交反應在疾病的靶向藥物遞送尤其是在活體中前藥的遞送和激活中有著廣泛的應用,這主要得益于生物正交剪切反 應 或 者 click-to-release 反 應 的 發 展.2014 年Bradley和 Uniciti-Broceta等首次利用具有生物相容性的零價鈀樹脂在斑馬魚的胚胎卵黃囊中催化剪切釋放出熒 光 探 針[84]。

　　這 個 研 究 直 接 促 進 了 4 年 后Weissleder等在小鼠體內利用 Pd納米材料催化釋放阿霉素的研究[85],由于該 Pd納米材料能有效地在腫瘤部位累積,這種策略可以極大降低阿霉素的毒副作用.Pd催化的生物正交剪切反應也可用于微針藥物遞送等領域.最近,Gu研究組開發了一款能夠實現化療藥增效減毒的生物正交 催 化 貼 劑 (BioorthogonalCatalyticPatch),將其貼在小鼠黑色素瘤周皮膚上,明顯減慢了腫瘤增殖速度[86].

　　5 總結與展望

　　生物正交反應為化學生物學發展和研究生命進程帶來了革命性的技術方法,為該領域的核心研究策略之一.過去的20年見證了眾多研究團隊對 CuAAC,SPAAC,IEDDA 等反應的機理、反應速率、反應前驅體的設計等進行的深入研究.由于其高度的專一性、較高的反應速率和良好的生物兼容性,生物正交反應在細胞和動物中有著越來越多的應用.研究者們可以對蛋白質、核酸、脂質、糖等生物大分子定點修飾進而成像,也可以對細胞、組織和活體動物等不同層面的生物結構進行觀測.

　　近年來由于藥物耐藥性問題的不斷出現,快速發現新的活性藥物骨架和新型疾病相關靶點抑制劑等方法備受關注.生物正交反應已經在激酶如乙酰膽堿酯酶抑制劑的發現中逐漸嶄露頭角,也加速了 PROTACs連接方式的優化.在疾病尤其是腫瘤的靶向治療中,生物正交剪切反應也受到了藥學研究者的青睞,既可以用于蛋白藥物的靶向遞送,也對小分子藥物在腫瘤部位的富集和滲透起到了極大的促進作用,從而提高了其治療效果并能降低藥物毒性.

　　不僅如此,生物正交反應對于在細胞中原位進行藥物靶點發現和藥物動力學研究也有重要意義,也可以與蛋白譜學分析技術相結合,提高藥物脫靶性研究的可靠性.在當今生物正交反應面臨反應新拓展和應用新升級的關鍵時期,研究效率更高、原料更加易得、相互正交性和生物兼容性更好的反應類型仍然是個長期挑戰,尤其是用于活體動物的生物正交反應升級更加迫切和艱巨.技術為應用而生,如何將這些革命性的技術應用在解決生命科學和原創新藥發現中,是生物正交反應的下一個重要發展方向.期待生物正交反應在臨床診斷、小分子藥物、蛋白質前藥和 ADC等藥學領域中有更加廣闊和有效的應用前景.

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　　作者：溫 琪1,2 羅嘉琰1,3 邵浩東1 鄧張雙4 滕 鵬1

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